《Industrial Crops and Products》：Integrated transcriptomic and phytohormone analyses provide insight into the regulation mechanisms of petal elongation in safflower (
Carthamus tinctorius L.)
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红花（Carthamus tinctorius L.）花开放过程中花冠的快速伸长主要由基部管状部分的细胞分裂和扩展驱动。全面的转录组分析揭示了调控红花花瓣发育的基因调控网络。两个BPE基因同源物可能通过调节细胞增殖和扩展来控制红花花瓣大小。生长素（auxin）
红花（Carthamus tinctorius L.）花开放过程中花冠的快速伸长主要由基部管状部分的细胞分裂和扩展驱动。全面的转录组分析揭示了调控红花花瓣发育的基因调控网络。两个BPE基因同源物可能通过调节细胞增殖和扩展来控制红花花瓣大小。生长素（auxin）和细胞分裂素（cytokinin）对红花花瓣伸长不可或缺。
红花（Carthamus tinctorius L.）是菊科（Asteraceae）一年生草本植物，全球广泛栽培，具有油用、染料和药用价值。干燥的管状花是传统中药的重要材料，具有活血化瘀、止痛等功效。因此，管状花产量是受头状花序直径、每花序小花数和花瓣大小等因素影响的关键农艺性状。然而，红花管状花花瓣生长发育的调控机制尚不清楚。与其他植物侧生器官类似，花瓣发育通常分为原基形成、细胞增殖和细胞扩展三个关键阶段。已有研究表明，花瓣最终大小主要由细胞分裂和扩展决定。花瓣中的细胞分裂主要发生在发育早期，增殖停止的时机影响最终花瓣大小。在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中已鉴定出多个控制花瓣细胞增殖的基因，如生长素诱导基因ARGOS通过延长细胞增殖持续时间促进花瓣增大，而CIN型TCP家族基因TCP5则通过抑制细胞增殖负调控花瓣大小。近五年来，在月季（Rosa hybrida）和薰衣草叶菊（Chrysanthemum lavandulifolium）等观赏植物中报道了一系列通过调控细胞增殖影响花瓣大小的基因。例如，NAC转录因子ClNAC84与ClMIP互作，通过诱导细胞周期蛋白依赖性激酶基因ClKRP5的表达抑制花瓣细胞增殖；在月季中，miR159通过靶向细胞分裂素氧化酶/脱氢酶6（CKX6）调节细胞分裂素水平来抑制花瓣细胞分裂，而RhMYB73、RhTPL和RhHDA19组成的复合体抑制RhmiR159的表达，因此MYB73/TPL/HDA19-miR159-CKX6模块通过调控细胞分裂素分解代谢调节花瓣大小。此外，RhMYC2基因直接激活细胞分裂素生物合成基因RhLOG3的表达，沉默RhMYC2导致花瓣变小。细胞分裂素信号蛋白RhARR14抑制细胞周期抑制因子RhKRP2，正向调控花瓣大小。当植物器官达到一定细胞数量后，细胞停止分裂并进入扩展阶段，在此期间细胞壁松弛和水分吸收导致细胞快速增大。BIGPETALp（BPEp）是控制花瓣细胞扩展的重要调控因子，是BIGPETAL的选择性剪接转录本，通过调控分裂后细胞扩展负调控花瓣大小。近五年来，在月季、菊花（Chrysanthemum × morifolium）和非洲菊（Gerbera hybrida）等主要观赏物种中发现了多个通过调控细胞扩展促进花瓣生长的基因。例如，沉默RhIAA14、RhNF-YC9和RhMYB6等基因会损害花瓣细胞扩展并减小花瓣大小；相反，在菊花中过表达CmTCP20促进花瓣细胞伸长，导致舌状花瓣显著增大；在非洲菊中，GhPRGL和两个14-3-3家族基因主要通过促进细胞伸长正向调控舌状花瓣长度。另一方面，也有多个负调控花瓣细胞扩展的基因被报道，如月季中的RhARF2、菊花中的CmJAZ1-like和CmGEG、非洲菊中的GhBPE。植物激素在花瓣发育过程中对细胞增殖和扩展的调控起关键作用。例如，外源生长素处理增加薰衣草叶菊花瓣长度；拟南芥ckx3ckx5双突变体中细胞分裂素含量增加促进花瓣细胞增殖，导致花瓣大小增加约40%；利用1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）和氨基乙氧基乙烯基甘氨酸（AVG）调控乙烯水平表明乙烯抑制非洲菊花瓣细胞扩展。最重要的是，几乎所有参与花瓣大小调控的关键转录因子都通过调节植物激素代谢、作用于植物激素信号通路或介导不同植物激素之间的交叉对话来发挥作用。红花头状花序仅由管状花组成，而其他菊科物种（包括薰衣草叶菊和非洲菊）的头状花序包含从外围到中心的三种不同小花类型：舌状花、过渡花和管状花。尽管在薰衣草叶菊、菊花和非洲菊中已鉴定出多个调控舌状花瓣大小的基因，但管状花花瓣大小调控的分子机制在很大程度上仍未被探索。本研究调查了红花管状花花瓣伸长过程中的形态动力学，并整合转录组和植物激素分析来阐明红花花瓣伸长的调控机制。研究结果将为理解红花管状花花瓣伸长的分子基础提供有价值的见解。
研究人员以红花品种'云红6号'为材料，在河北工程大学上壁实验田栽培。用于RNA测序的管状花花瓣（去除子房）在四个发育阶段采集，五个头状花序的花瓣混合形成一个生物学重复。用于外源激素处理的S1期管状花花瓣从花序上分离，置于浸有含NAA（10 μM）、6-BA（10 μM）或ddH2O的液体MS培养基的滤纸上，在25°C±1°C黑暗条件下孵育五天。用于qRT-PCR分析的样品在外源激素处理后1、2、4和8小时采集。使用Trizol试剂提取四个发育阶段管状花的总RNA，构建12个cDNA文库并在MGISEQ-2000平台测序。原始数据经SOAPnuke过滤，clean reads用HISAT2比对到红花参考基因组，基因表达水平以FPKM量化，使用DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs），标准为|log2(FoldChange)| ≥ 1且FDR < 0.05，随后进行GO和KEGG富集分析。qRT-PCR以CtEF-1α为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。扫描电子显微镜（SEM）观察不同发育阶段花瓣中部区域，细胞大小用ImageJ软件测量。内源激素含量采用UPLC-MS/MS测定。统计分析使用SPSS软件，采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验，P < 0.05视为显著差异。
3.1 红花花开放过程中管状花的形态特征：红花管状花由子房、花冠基部管状部分和顶部裂片部分组成。花开放期间花瓣在短时间内快速伸长。研究人员采集了四个发育阶段样品：S1（管状部与裂片部长度比=1:3）、S2（管状部与裂片部长度比=1:1）、S3（开花期）和S4（开花后两天）。形态分析显示裂片部从S1到S4无显著伸长，而基部管状部从S1到S3剧烈伸长，表明红花开花期间花瓣快速伸长主要归因于基部管状部的生长。通过SEM观察不同发育阶段表皮细胞，细胞长度从S2到S3显著增加（细胞扩展期），而S1到S2细胞长度无显著变化但细胞数量增加（细胞增殖期），表明该时期花瓣长度增加由细胞分裂驱动。此外，S3期细胞宽度显著减小，与细胞长度快速增加同时发生，表明表皮细胞扩展过程中可能发生细胞壁重建。
3.2 转录组分析及DEGs鉴定：为阐明红花花瓣伸长的分子机制，对四个发育阶段花瓣进行转录组测序。12个cDNA文库产生约3.885亿clean reads，Q30评分高于92.54%，唯一比对率超过87.31%。共鉴定出27,089个在至少一个阶段表达的基因，生物学重复间相关系数为0.96-0.99，PCA分析显示样品按发育阶段清晰分离。以|log2(FoldChange)| ≥ 1且FDR < 0.05为阈值，在S1 vs. S2、S2 vs. S3和S3 vs. S4比较中分别鉴定出6792个（3126上调、3666下调）、6428个（3352上调、3076下调）和5022个（2627上调、2395下调）DEGs。
3.3 DEGs富集分析：KEGG富集分析显示，S1 vs. S2比较中DEGs显著富集于DNA复制、戊糖和葡萄糖醛酸互变、淀粉和蔗糖代谢及植物激素信号转导等通路；S2 vs. S3比较中DEGs主要映射到苯丙烷生物合成、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢等通路；S3 vs. S4比较中DEGs显著富集于植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢和苯丙烷生物合成等通路。值得注意的是，植物激素信号转导、精氨酸和脯氨酸代谢、苯丙烷生物合成、不饱和脂肪酸生物合成和淀粉和蔗糖代谢五个KEGG通路在所有三个比较中均显著富集，表明参与植物激素信号转导的基因可能在介导红花花瓣伸长中起关键作用。
3.4 植物激素信号通路相关DEGs：鉴于植物激素信号转导通路在KEGG分析中的持续富集，研究人员重建了生长素和细胞分裂素信号通路。在生长素通路中，大多数编码AUX1、TIR1、AUX/IAA、ARF、GH3和SAUR蛋白的基因在花瓣发育过程中显示显著差异表达。多个AUX/IAA基因和两个ARF基因在S3期表达急剧增加，与花瓣快速伸长时期一致。在细胞分裂素信号通路中，多个CRE1、B-ARRs和A-ARRs基因在前三个发育阶段（S1-S3）转录丰度较高。这些不同的表达模式表明生长素信号主要在细胞扩展期（S2-S3）活跃，而细胞分裂素信号主要在细胞增殖期（S1-S2）发挥作用。
3.5 花瓣伸长过程中细胞扩展相关DEGs鉴定：植物木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶（XTH）通过介导细胞壁中木葡聚糖交联的切割和再连接在细胞扩展中起关键作用。转录组数据鉴定出44个XTH基因，其中多个在S3期高度上调，特别是CtXTH17、CtXTH20、CtXTH31、CtXTH36和CtXTH40。扩展蛋白（expansin）家族基因也参与细胞扩展，共检测到34个扩展蛋白家族基因，包括18个α-扩展蛋白（EXPA）、11个β-扩展蛋白（EXPB）、3个类扩展蛋白A（EXLA）和2个类扩展蛋白B（EXLB）。值得注意的是，几乎所有EXPB基因在花瓣发育过程中表达水平相对低于EXPA基因。在EXPA和EXLA基因中，CtEXPA8a、CtEXLA1a和CtEXLA1b在S3期表达显著增加，表明它们参与花瓣细胞扩展；而CtEXPA8b转录丰度在S2期显著增加并达到峰值。除细胞壁修饰外，细胞扩展通常伴随大量水分吸收，水通道蛋白（aquaporin）促进跨膜水分运输。研究注释了39个水通道蛋白基因，包括14个质膜内在蛋白（PIPs）、12个液泡膜内在蛋白（TIPs）、6个类NOD26内在蛋白（NIPs）和7个小碱性内在蛋白（SIPs）。五个PIP基因和四个TIP基因在所有发育阶段高表达并在S3期进一步上调。这些结果表明多类细胞扩展相关基因协同参与红花花瓣伸长。
3.6 参与红花花瓣伸长的转录因子鉴定：研究鉴定出所有比较组中共727个差异表达转录因子。使用基于C-means聚类的Mfuzz方法进行时间表达模式分析，727个差异表达转录因子被分为六个不同簇。亚类5的表达谱与细胞扩展期高度相关，亚类6与细胞增殖期同步。亚类5中的127个转录因子属于22个转录因子家族，主要为AP2（6个）、ARF（11个）、bHLH（10个）、HB-PHD（7个）和MYB（9个）；亚类6中的118个转录因子属于23个家族。令人惊讶的是，S1Fa-like家族在两个亚类中均高度富集，表明其在红花花瓣发育中具有重要但尚未被表征的作用。共鉴定出263个差异表达的S1Fa-like家族转录因子，占红花花瓣发育过程中所有差异表达转录因子的三分之一以上。系统发育分析表明这些蛋白聚为五类，其中第V类成员最少（37个），第IV类成员最多（75个），第I、II和III类分别有66、46和39个成员。S1Fa-like基因的表达谱与系统发育树整合后未观察到表达模式与系统发育分组之间的明显相关性。聚类表达热图显示，第I组基因主要在S2期表达，第III组在S1期达到峰值，第V组和第VII组基因分别在S4和S3期表达最高，这些阶段特异性表达模式表明不同组的S1Fa-like基因可能在花瓣发育的阶段转换中发挥重要作用。鉴于bHLH转录因子在花瓣扩展中的重要作用，研究人员选择了四个高表达且倍数变化大的bHLH基因进行进一步探索：一个来自亚类5（CtAH03G0266400），三个来自亚类6（CtAH09G0160500、CtAH07G0018800和CtAH02G0119600）。与拟南芥同源物的系统发育分析显示CtAH07G0018800和CtAH02G0119600是BIGPETAL（BPE）的同源物，CtAH03G0266400与LHW3聚类紧密，CtAH09G0160500与MRG21.2同源。qRT-PCR组织特异性表达分析证实所有四个基因主要在花中表达，支持其在花瓣发育中的作用。此外，它们的表达响应外源生长素和细胞分裂素处理，表明它们可能功能于激素信号通路下游。
3.7 红花花瓣伸长过程中内源激素含量变化：使用HPLC法测定了不同发育阶段红花花瓣中IAA、CK、JA、SA和ABA的含量。IAA含量从S1到S3保持较高水平，但在S4期急剧下降。在花瓣伸长过程中，细胞分裂素（二氢玉米素核苷，DHZR）和ABA呈现相似趋势，在S1期达到峰值后逐步下降。相比之下，JA水平在S1和S2期较低，S3期显著增加，S4期显著下降。SA浓度在S2期达到最高水平。植物激素稳态由生物合成、运输和分解代谢途径协同调节。在生长素生物合成途径中，鉴定出三个TAA1和十三个YUCCA差异表达基因，其中仅两个TAA1基因在前三个发育阶段表达较高，而所有YUCCA基因在S1和S2期转录丰度较低，这些生物合成基因的表达模式与内源生长素水平相关性不密切，表明花瓣生长素可能主要通过从其他器官运输供应。IAA活性和结合形式之间的可逆互变由ILR1和GH3酶催化，编码这些酶的基因的动态表达表明生长素含量的精细调控。结合态IAA的不可逆失活由DAO介导，鉴定出27个DAO基因为DEGs，其中几个在花瓣伸长停止后的后期发育阶段上调。分析表明DHZR是红花花瓣中的主要活性细胞分裂素，但编码关键生物合成酶的基因（特别是IPT和CYP735A）在整个发育过程中表达持续较低，且转录组中未检测到催化tZRP转化为DZRP的还原酶基因。相比之下，CKX基因在花瓣后期表达较高且增加，表明花瓣细胞分裂素主要从其他组织输入，其稳态主要通过降解调节。
3.8 外源激素处理对红花花瓣伸长的影响：为进一步验证植物激素在红花花瓣伸长中的作用，对S1期管状花进行外源6-BA和NAA处理。在不含激素的液体MS培养基上培养的花瓣五天后未能正常伸长，表明花瓣伸长依赖其他植物器官供应的激素。相比之下，6-BA或NAA处理均促进花瓣伸长，但最终长度未达到体内花瓣长度。进一步形态学检查显示激素诱导的伸长主要归因于花瓣基部管状部的扩展。表皮细胞分析显示6-BA处理促进细胞增殖和扩展，而NAA处理显著增强细胞伸长但显著抑制细胞分裂。
讨论部分：红花花瓣大小主要由管状花长度决定。在模式植物拟南芥中，花开放由花瓣基部表皮细胞伸长驱动，而上部表皮细胞通常不显著伸长。在薰衣草叶菊中也观察到类似模式。本研究结果与这些发现一致：红花花瓣快速伸长期间，基部管状部表皮细胞数量和细胞长度均大幅增加，而顶部裂片部长度基本不变，表明红花花瓣伸长主要由基部管状区表皮细胞伸长驱动，这一机制在拟南芥和薰衣草叶菊等物种中保守。先前研究表明bHLH、ARF、TCP和AP2/ERF等多个转录因子家族的转录因子通过控制细胞分裂和扩展调控花瓣大小，其中bHLH转录因子在多个物种中发挥突出作用。本研究转录组分析鉴定出727个差异表达转录因子，包括41个bHLH成员。十个bHLH基因（包括BPE同源物CtAH02G0119600）在S2到S3期显著上调，与花瓣细胞快速扩展期一致；另外六个bHLH基因（包括另一个BPE同源物CtAH07G0018800）在S1到S2期表达增加，该时期花瓣生长主要由细胞增殖驱动。两个BPE同源物的花瓣特异性表达表明它们可能通过调控细胞增殖和扩展控制红花花瓣大小。研究还鉴定出263个在花瓣发育过程中差异表达的S1Fa-like转录因子。S1Fa-like蛋白是低分子量转录因子，通常以膜锚定的非活性状态存在。S1Fa-like基因数量在不同植物物种间差异很大，大多数物种不超过五个，而花生（Arachis hypogaea L.）拥有超过100个成员。S1Fa-like转录因子在植物中的功能表征鲜有报道，近期报道表明过表达水稻OsS1Fa1基因的转基因拟南芥植株表现出增强的耐旱性，PtS1Fa2响应干旱胁迫并通过增加抗氧化活性赋予转基因植株耐旱性。这些结果表明S1Fa-like转录因子在介导植物非生物胁迫响应中起关键作用，但其在植物发育过程中的参与尚未见报道。本研究发现S1Fa-like基因在红花花瓣发育过程中表现出阶段特异性表达模式，表明其在红花花瓣发育中具有重要但有待阐明的功能。基于其在其他植物物种干旱胁迫下的生理作用，研究人员推测S1Fa-like基因可能参与红花花瓣伸长过程中的水分吸收和运输调节，但需要通过基因过表达或敲除进一步功能表征。生长素和细胞分裂素是协调调控花瓣细胞分裂和扩展的必需植物激素。外源生长素处理增强鸢尾花开放速率和角度；在拟南芥中AUX1突变减少生长素积累导致花瓣变短；ARF8蛋白与BPEp协同作用限制早期有丝分裂活性并抑制后期细胞扩展。在月季中，生长素调控的RhARF2通过调节RhMYB6表达控制花开放。细胞分裂素主要通过调控细胞增殖影响器官大小，外源细胞分裂素处理增加月季花瓣大小。细胞分裂素响应转录因子RhRAP2.4L促进细胞周期抑制因子RhKRP2表达并抑制细胞扩展调控因子RhBIG PETALub，沉默RhRAP2.4L导致花瓣变小。与这些结果一致，研究人员观察到在MS培养基上培养的离体红花花瓣伸长极少，而外源施加生长素或细胞分裂素均促进花瓣伸长，表明两种激素对红花花瓣发育均不可或缺，且花瓣大小控制中可能存在两种信号通路间的交叉对话。然而外源生长素处理导致管状部细胞数量显著减少，表明生长素对红花花瓣细胞分裂可能有抑制作用。考虑到生长素和细胞分裂素在植物各种发育过程中相互协调以及生长素调控植物生长发育的浓度依赖性，研究人员提出观察到的生长素抑制现象可能是由于高浓度外源生长素打破了生长素和细胞分裂素之间的平衡。花开放期间花瓣的快速伸长主要由细胞扩展驱动，参与这一过程的基因如编码EXPANSINs（EXPAs）、XTHs和水通道蛋白的基因在转录和激素调控网络的末端发挥作用。本研究中观察到多个细胞扩展相关基因在红花花瓣快速伸长阶段表达上调，强调了它们在这一过程中的重要作用。基于研究结果，提出了红花花瓣伸长的假设调控模型：红花花瓣伸长由两个序贯阶段协调：细胞增殖期（S1-S2），较高的细胞分裂素水平可能通过推定的下游bHLH转录因子如CtAH07G0018800和CtAH02G0119600促进细胞分裂；一旦达到一定细胞数量，过程转向细胞扩展期（S2-S3），主要由生长素调控，高生长素水平可能通过潜在bHLH转录因子（CtAH03G0266400）激活下游细胞扩展相关基因；此外，增殖与扩展之间转换的精确时机可能由生长素和细胞分裂素信号通路之间的互作精细调控。
结论部分翻译：形态学分析揭示红花管状花瓣的快速伸长由S1到S2期的细胞增殖驱动，随后由S2到S3期的细胞扩展驱动。转录组分析和外源激素处理表明细胞分裂素和生长素在红花管状花伸长过程中均发挥重要作用。此外，研究鉴定出bHLH转录因子，特别是BPE同源物CtAH02G0119600和CtAH07G0018800，作为介导细胞分裂素和生长素信号对细胞增殖和扩展影响的潜在下游调控因子。总之，这些发现为理解红花管状花伸长的分子机制提供了基础框架。
