发根农杆菌介导的基因型灵活葡萄毛状根转化体系建立及VvAIL12作为再生关键调控因子的鉴定

《Horticultural Plant Journal》：Development of a genotype-flexible hairy root transformation system and identification of VvAIL12 as a key regulator of grapevine regeneration

　　

葡萄（Vitis vinifera L.）的遗传转化与功能基因组学研究受限于低效率和基因型依赖性。本研究优化了外植体状态和发根农杆菌（Rhizobium rhizogenes）侵染参数，确定了R. rhizogenes介导的毛状根转化的最优条件。在标准化条件下评估了12个葡萄基因型的毛状根转化效率，揭示了显著的基因型变异，‘Marselan’和‘SO4’分别表现出最高和最低的效率。全基因组范围的AIL基因家族分析鉴定出VvAIL12为毛状根再生过程中强烈诱导的基因。功能验证表明，操纵VvAIL12的表达可部分缓解基因型依赖性：其过表达促进了‘SO4’中的根系形成，使毛状根转化效率从9.92%提升至27.78%；而其敲低则抑制了‘Marselan’中的根系发育，使效率从45.40%降至20.72%。值得注意的是，操纵VvAIL12的表达并未显著影响转基因愈伤组织的诱导，而是促进了从转基因愈伤组织向毛状根的转变。通过将生理学优化与靶向遗传调控相结合，研究人员为葡萄建立了一种高效且降低基因型依赖性的毛状根转化体系（HRTS）。此外，还开发了一个用于转基因毛状根的in vivo细胞分辨率可视化平台。这些发现为葡萄的功能基因组学、基因编辑和品种改良奠定了基础。

研究背景与科学问题

葡萄（Vitis vinifera L.）是全球重要的园艺作物，服务于葡萄酒生产、鲜食消费、果汁加工和干果产业等多个领域。通过遗传工程和基因编辑进行葡萄品种改良，前提条件是拥有高效的转化体系。目前，葡萄的转化主要依赖于体细胞胚胎发生和器官发生途径，但这些常规体系在实际应用中受到严重制约：转化效率普遍较低，体细胞胚胎发生通常低于5%，器官发生低于3%；植株再生缓慢，常需一年以上时间；成功应用主要局限于少数品种如‘Thompson Seedless’和‘Chardonnay’，表现出强烈的基因型依赖性。此外，这些方法高度依赖植物生长调节剂特别是生长素和细胞分裂素的精确调控，这往往损害实验的可重复性。因此，大规模生产转基因葡萄植株对全球大多数实验室而言仍是重大技术障碍。

相比之下，发根农杆菌（R. rhizogenes）介导的毛状根转化体系（HRTS）具有减少基因型依赖性、缩短转化周期（可在四周内产生功能性转基因毛状根）、以及根系稳定遗传和激素自养生长等优势，非常适合基因功能分析。然而，基于HRTS的转基因根诱导在葡萄中仅在少数品种如‘Muscat Hamburg’和‘Crimson Seedless’中有报道，且整体效率仍然较低。同时，愈伤组织培养方案的精细化、以及对AINTEGUMENTA-LIKE（AIL）基因家族等关键发育调控因子的挖掘，为提高再生效率提供了新的可能。因此，本研究旨在通过整合关键转化参数的优化与遗传调控，建立一个基因型灵活的、高效的葡萄毛状根转化体系，并鉴定其中的关键调控因子。

主要关键技术方法

研究人员使用了来自山东省葡萄研究院组培中心的12个葡萄基因型（包括8个栽培品种和4个砧木）的组培苗作为外植体。关键技术包括：利用发根农杆菌（R. rhizogenes）菌株K599进行侵染，并通过优化外植体苗龄、菌液浓度（OD₆₀₀）和共培养时间来建立高效转化流程；采用绿色荧光蛋白（GFP）荧光结合PCR验证进行转基因组织筛选；通过全基因组BLASTP比对和系统发育分析鉴定葡萄AIL（VvAIL）基因家族；运用qRT-PCR分析基因时空表达模式；构建过表达和RNA干扰载体进行基因功能验证；以及利用激光共聚焦显微镜建立同源背景下的亚细胞定位平台。

研究结果

3.1 R. rhizogenes介导的葡萄HRTS关键变量的优化

研究人员首先通过设置无农杆菌的模拟接种对照，证实了伤口和培养条件本身不能诱导愈伤或根系形成，而只有农杆菌感染才能产生GFP阳性的愈伤组织和毛状根，并经PCR验证了GFP荧光筛选的可靠性。随后，他们比较了不同组培苗继代时长（30、45、60天）对外植体再生的影响，发现45天苗龄的外植体在愈伤诱导率、转基因愈伤诱导率、根诱导率和转基因根诱导率四项指标上均表现最佳，其中转基因愈伤和转基因根诱导率分别达到45.19%和32.85%。进一步测试了三种菌液密度（OD₆₀₀=0.4、0.8、1.2）与三种共培养时间（1、2、3天）的组合，结果表明OD₆₀₀=0.8配合2天共培养可获得最高的根诱导和转基因根诱导效率（后者达43.76%）。

3.2 不同葡萄基因型间转基因毛状根再生效率的差异

在优化条件下（45天苗龄、OD₆₀₀=0.8、2天共培养），研究人员评估了12个基因型的再生性能，观察到显著的基因型差异。尽管‘Chardonnay’的总愈伤诱导率最高，但其转基因愈伤效率低于‘Manicure Finger’、‘Marselan’和‘Thompson Seedless’。同样，虽然‘Thompson Seedless’总根诱导率最高，但其转基因根诱导率仅排在第9位。转基因根诱导率最高的是‘Marselan’，其次是‘Manicure Finger’和‘Chardonnay’。这表明内在再生能力并不一定预示转基因表现，并确定了‘Marselan’和‘Manicure Finger’为特别适合毛状根转化的基因型。

3.3 葡萄AIL转录因子家族的基因组与进化分析**

通过BLASTP搜索和结构域确认，研究人员在葡萄基因组中鉴定出16个AIL基因，命名为VvAIL1–VvAIL16。系统发育分析将16个VvAIL蛋白与拟南芥和苹果的同源蛋白分为四个分支（Group I–IV）。复制事件分析未发现串联重复，但检测到5对片段重复，涉及62.5%的VvAIL基因。跨物种共线性分析显示，葡萄与双子叶植物的直系同源对数量远多于单子叶植物，符合进化关系。

3.4 VvAIL基因的结构与调控特征

保守基序和内含子-外显子结构分析显示，所有VvAIL成员共享两个AP2/ERF结构域，但不同分组在基序分布和外显子数目上存在差异（Group I: 7–9个，Group II: 7–8个，Group III: 6个，Group IV: 9–10个）。启动子区顺式作用元件分析发现，各组富含不同类型的响应元件：Group I以厌氧诱导元件为主，Group II以光响应元件为主，Group III富含脱落酸响应元件，Group IV则以茉莉酸甲酯响应元件为主。生长发育相关元件在Group I和II中更丰富。

3.5 VvAIL基因在不同葡萄组织及转基因毛状根再生过程中的表达分析

组织特异性表达谱显示，VvAIL基因在多数组织中广泛稳定表达，但存在明显的组间和组织间差异：Group IV成员表达分布最广，Group I成员在芽发育期高表达。在‘Marselan’毛状根诱导的时间进程分析中，VvAIL4、VvAIL5、VvAIL6、VvAIL12和VvAIL16在侵染后显著上调，其中VvAIL12和VvAIL5的诱导持续增强。这些强诱导基因均属于Group I，暗示该亚群在转基因毛状根形成中发挥重要作用。

3.6 VvAIL12促进葡萄转基因愈伤组织分化为毛状根

由于VvAIL12与拟南芥的关键调控因子AtBBM和AtAIL5高度同源，且其在21 DPI时的表达水平与12个基因型的转基因毛状根效率呈正相关，研究人员将其选作候选基因进行功能验证。在低效砧木‘SO4’中过表达VvAIL12，使转基因毛状根诱导率从9.92%提高到27.78%；而在高效品种‘Marselan’中沉默VvAIL12，该效率从45.40%降至20.72%。重要的是，VvAIL12的操纵不影响转基因愈伤诱导率，而是显著改变了转基因愈伤分化出毛状根的比例（‘SO4’中从17.17%升至52.84%；‘Marselan’中从65.24%降至32.34%），证明VvAIL12正向调控从转基因愈伤向毛状根的转变过程。

3.7 ‘Thompson Seedless’与两种对比基因型中VvAIL12及根系发育相关基因的表达动态比较**

为探究‘Thompson Seedless’高效诱导转基因愈伤但毛状根形成受限的原因，研究人员比较了‘Marselan’、‘SO4’和‘Thompson Seedless’三个基因型在再生过程中VvAIL12及五个根系发育相关基因的表达动态。在‘Marselan’中，VvAIL12、VvARF7、VvLBD16、VvWOX5和VvPLT1总体呈递增趋势，在21 DPI达到峰值；VvWOX11则在7和14 DPI高表达后下降。在‘Thompson Seedless’中，VvARF7、VvWOX11和VvLBD16呈现瞬态表达模式（14 DPI诱导后大幅下降），VvAIL12在14 DPI后不再升高，VvWOX5和VvPLT1虽逐渐积累但低于‘Marselan’。在‘SO4’中，所有六个基因的诱导均很弱或有限。这表明‘Thompson Seedless’的根系起始程序激活较为短暂或不持久，特别是VvWOX11的延迟诱导和VvAIL12、VvLBD16后期积累不足，可能是其毛状根形成受限的原因。

3.8 葡萄转基因毛状根in vivo细胞分辨率可视化平台的建立**

研究人员建立了基于同源葡萄转基因毛状根的in vivo亚细胞定位平台，成功表达了线粒体、内质网、肌动蛋白细胞骨架和细胞核等多种GFP标记的细胞器标志物。利用该平台，他们证实VvAIL12-GFP融合蛋白定位于细胞核，这一结果与本氏烟草异源系统中的定位一致，验证了该平台的可靠性。

讨论与结论总结

讨论部分指出，传统葡萄转化体系受限于低效率（<5%）、长周期（≥4个月）和强基因型依赖性。本研究通过优化外植体年龄（45天苗龄叶片效果最好，平衡了发育能力和胁迫耐受性）和侵染参数（OD₆₀₀=0.8配合2天共培养，针对葡萄叶片易褐变特点缩短了共培养时间），并结合遗传调控，建立了高效的HRTS。该体系能在3–4周内从12个基因型中获得GFP阳性转基因毛状根。针对基因型依赖性问题，研究人员发现VvAIL12（AtBBM/AtAIL5的直系同源基因）在毛状根再生中强烈诱导，其表达水平与转化效率正相关。功能验证表明，VvAIL12主要通过促进转基因愈伤向毛状根的转变来提高效率，而不影响愈伤的初始诱导。对‘Thompson Seedless’的分析进一步揭示，基因型依赖性不仅取决于形成转基因愈伤的能力，还取决于后续根系分化程序的强度和时序协调性，其中VvAIL12是关键的正调控因子。此外，建立的同源毛状根基质亚细胞定位平台比异源系统更具生物学相关性。

结论部分翻译如下：总之，研究人员为葡萄建立了一个高效且基因型灵活的发根农杆菌（R. rhizogenes）介导的毛状根转化体系（HRTS）。最终确定的方案使用45天龄组培苗的叶片，经50 μmol·L^-1乙酰丁香酮诱导2小时的R. rhizogenes菌株K599（OD₆₀₀=0.8）侵染1分钟，并在半强度MS培养基上暗共培养2天。随后将外植体转移到含300 mg·L^-1替门汀的无激素1/2 MS培养基上，可在3–4周内获得转基因毛状根。将VvAIL12整合到转化载体中，可进一步增强转基因愈伤组织向毛状根的分化，从而显著减轻基因型依赖性限制并提高顽固性葡萄基因型的转化效率。此外，还开发了一个用于in vivo亚细胞定位的同源毛状根基质平台。总体而言，该系统为葡萄及其他顽固性果树作物的功能基因组学和分子育种提供了一个实用且多功能的工具包。