水杨酸通过NPR1-ACO3调控模块延缓砂梨果实衰老

《Horticultural Plant Journal》：Salicylic acid delays sand pear senescence via an NPR1- ACO3 regulatory module

　　

果实衰老是一个多层面、受激素调控的过程，然而，乙烯与水杨酸（SA）信号在梨果实中的分子互作在很大程度上仍未阐明。研究人员从经SA处理的砂梨（*Pyrus pyrifolia*）的转录组分析中鉴定出*PpACO3*。在本研究中，研究人员进行了全基因组分析，鉴定出13个1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶（ACO）基因，并突出表明*PpACO3*是一个具有膜定位特征和SA响应性启动子元件的独特成员。功能鉴定揭示，*PpACO3*整合激素信号以调控果实衰老：其表达受SA强烈抑制，但受乙烯诱导，并呈现发育阶段特异性和组织特异性模式。*PpACO3*的病毒诱导基因沉默延缓了果实皱缩，抑制了乙烯产生，并增强了抗氧化防御能力，而在番茄和梨愈伤组织中的过表达则加速了衰老，加剧了氧化损伤，并促进了细胞壁降解。在机制上，*PpACO3*直接被SA信号受体PpNPR1所抑制，从而在SA感知与乙烯介导的衰老之间建立了分子联系。综上所述，这些发现将PpACO3鉴定为协调SA与乙烯信号通路以调控果实衰老的核心调控因子，为延长采后货架期和改善果实品质提供了潜在靶点。

果实衰老是一个由激素网络精密调控的程序化生理过程，其中乙烯作为关键的促衰老激素，在呼吸跃变型果实成熟与衰老进程中发挥核心作用，而水杨酸（SA）则被证实能够抑制乙烯合成并延缓果实衰老进程。尽管这两种激素在果实衰老中的功能已有广泛研究，但二者在梨果实中分子层面的互作机制仍不清楚，特别是SA信号通路如何直接调控乙烯生物合成关键基因，尚缺乏深入解析。基于这一科学问题，研究人员以砂梨（*Pyrus pyrifolia*）为研究对象，旨在阐明SA信号通过NPR1-ACO3调控模块延缓果实衰老的分子机制，为延长采后货架期提供理论依据和潜在基因靶点。

研究人员首先通过全基因组鉴定获得13个PpACO基因家族成员，系统发育分析表明PpACO3是Group III分支的唯一成员，其蛋白定位于细胞质和细胞膜，启动子区含有SA响应性TCA元件。表达分析显示，PpACO3受SA显著抑制而受乙烯强烈诱导，在果实采后贮藏期间表达量随衰老进程显著上升。功能研究中，研究人员利用病毒诱导基因沉默（VIGS）技术沉默了砂梨果实中的PpACO3，结果表明其可延缓果实皱缩、降低ACO酶活性和乙烯释放速率，同时提高内源SA含量并增强抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性，减少丙二醛（MDA）、超氧阴离子（O??）和过氧化氢（H?O?）积累，维持果实硬度并通过降低多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果胶甲酯酶（PME）和纤维素酶（CX）活性抑制细胞壁降解。相反，在番茄和梨愈伤组织中异源或同源过表达PpACO3则加速果实成熟与衰老，表现为乙烯产量升高、SA含量下降、氧化损伤加剧、细胞壁降解增强。在调控机制解析中，研究人员通过酵母单杂交（Y1H）和双荧光素酶报告实验证实，SA信号受体PpNPR1可直接结合PpACO3启动子区域并抑制其转录，从而建立了SA信号通路与乙烯合成之间的直接分子连接。

该研究系统揭示了PpNPR1-PpACO3调控模块在SA介导的果实衰老抑制中的核心作用。SA通过激活其受体PpNPR1，直接抑制PpACO3的转录，进而降低乙烯生物合成速率，并协同调节抗氧化系统与细胞壁代谢，最终延缓果实衰老。这一发现阐明了SA与乙烯信号通路间新的交叉调控节点，为果实衰老的激素协同调控理论提供了重要补充，同时也为砂梨及其它呼吸跃变型果实的采后保鲜技术开发提供了潜在的分子靶点。

**研究采用的关键技术方法**

研究人员主要运用了以下核心技术手段：全基因组鉴定与生物信息学分析（利用GDR数据库、HMM搜索及MEGA 7.0构建系统发育树）；亚细胞定位分析（通过农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达及共聚焦显微镜观察）；病毒诱导基因沉默（VIGS）技术进行果实体内基因功能丧失研究；番茄遗传转化获得稳定过表达株系；梨愈伤组织同源过表达体系；酵母单杂交（Y1H）和双荧光素酶报告系统验证转录因子-启动子相互作用；qRT-PCR、气相色谱、分光光度法等生理生化测定技术。其中所采用的砂梨品种为‘Whangkeumbae’和‘Akizuki’，果实采自中国河北保定。番茄转化采用Micro-Tom品种，梨愈伤组织诱导自砂梨果实。

**研究结果**

**3.1 砂梨ACO基因的全基因组鉴定与分子特征分析**：通过同源搜索和结构域筛选，从砂梨基因组中鉴定出13个PpACO基因，命名为PpACO1–PpACO13。系统发育分析显示PpACO3属于Group III分支，与苹果ACO同源蛋白亲缘关系最近。保守结构域分析确认所有PpACO蛋白均含有2OG-FeII_Oxy（PF03171）和DIOX_N（PF14226）结构域。亚细胞定位预测及烟草瞬时表达验证表明PpACO3定位于细胞质和细胞膜。启动子顺式作用元件分析发现，PpACO3启动子富含激素响应元件，特别是SA相关的TCA元件。

**3.2 PpACO3在砂梨果实衰老过程中受SA和乙烯调控**：对13个PpACO基因进行SA处理表达谱分析，发现PpACO3是响应最显著的家族成员，其表达在0.02、0.2和2 mmol·L?1 SA处理下均被强烈抑制，且在0.2 mmol·L?1 SA处理3小时即发生显著下调并持续至48小时。相反，乙烯利（ETH）处理则显著诱导PpACO3表达。组织特异性分析表明PpACO3在花瓣中表达量最高，且果实采后贮藏期间其表达量随衰老进程显著上升，表明该基因参与衰老调控。

**3.3 瞬时沉默PpACO3延缓砂梨果实衰老**：利用VIGS技术沉默采后砂梨果实中的PpACO3显著延缓了果实皱缩现象，SA处理进一步增强了这一延缓效应。基因沉默导致ACO酶活性和乙烯产生速率显著降低，内源游离态和结合态SA含量升高。沉默果实中MDA、O??和H?O?含量显著下降，SOD、POD、CAT活性及其编码基因PpSOD1、PpPOD1、PpCAT1的表达均上调，表明抗氧化能力增强。果实硬度得到更好保持，可溶性固形物含量（SSC）维持较高水平，细胞壁降解酶PG、PME、CX活性及其基因表达均受到抑制。

**3.4 过表达PpACO3加速番茄果实衰老**：在番茄中异源过表达PpACO3使果实从开花到破色期的时间显著缩短，加速了成熟启动。PpACO3-OE番茄果实采后失水皱缩加快，第10天即出现严重脱水和萎缩，ETH处理加重了这一衰老表型而SA处理则有效缓解。生理测定显示，过表达株系ACO活性、乙烯产量升高而SA含量降低，MDA、O??和H?O?积累增加，抗氧化酶活性下降，果实硬度降低、细胞壁降解酶活性升高，SSC含量下降。

**3.5 PpACO3促进砂梨愈伤组织衰老**：在砂梨愈伤组织中同源过表达PpACO3，培养40天后与野生型相比出现更明显的褐化、硬化和脱水等衰老症状。ACC处理加剧了这一表型而SA则有效抑制。过表达愈伤组织中ACO活性升高、SA含量降低，氧化胁迫指标上升、抗氧化酶系统受抑制，细胞壁降解酶活性及基因表达上调，进一步验证了PpACO3促进衰老的功能。

**3.6 PpNPR1通过直接结合启动子抑制PpACO3表达**：酵母单杂交实验表明，PpNPR1可特异性结合PpACO3启动子P1区域，而PpTGA2.1-L则无此结合能力。双荧光素酶报告实验证实，PpNPR1与PpACO3启动子共表达可显著降低LUC/REN比值，表明PpNPR1作为转录抑制子直接结合PpACO3启动子并抑制其转录活性，从而建立了SA受体与乙烯生物合成基因之间的直接调控连接。

**讨论与结论**

讨论部分指出，ACO基因家族在不同物种中数量各异，砂梨中鉴定出13个PpACO基因。PpACO3的组织表达模式与激素响应特性与其他物种中的ACO同源基因存在显著差异，其受SA抑制而受乙烯诱导的拮抗性表达调控体现了激素交叉互作的精妙机制。沉默PpACO3所引发的内源SA含量升高并非源于PpPAL3或PpICS2的转录激活，提示存在其他反馈调控节点。研究还指出，PpACO3过表达降低番茄SSC，暗示敲除该基因可能提高砂梨果实可溶性固形物含量，具有潜在的品质改良价值。研究结论为：SA信号通过其受体PpNPR1直接结合并抑制PpACO3启动子，从而下调乙烯生物合成，协同增强抗氧化防御并抑制细胞壁降解，最终延缓砂梨果实衰老。PpNPR1-PpACO3调控模块为果实衰老的激素协同调控提供了新的分子模型，通过调控PpACO3或其上游调控因子，可为延长砂梨及其他呼吸跃变型果实的采后货架期提供新策略。研究同时指出，未来利用CRISPR/Cas9技术在砂梨中进行基因敲除将提供更直接的遗传学证据。