Fmr1-/-小鼠海马发育期星形胶质细胞P2Y2受体表达上调及钙反应异常

《Glial Health Research》：Aberrant astrocyte signalling during hippocampal development in the Fmr1-knockout mouse model

　　

脆性X综合征（Fragile-X Syndrome，FXS）是儿童智力障碍的主要遗传病因，由脆性X信使核糖核蛋白（fragile X messenger ribonucleoprotein，FMRP）缺失所致，FMRP是一种mRNA调控蛋白。由于海马区主要参与学习和记忆，海马区发育一直是FXS研究的重点，且多数工作集中于环路内神经元的内在功能障碍。星形胶质细胞等胶质细胞在FXS海马中的潜在病理作用及其分子机制仍很大程度上未知。Fmr1^-/-（knockout，KO）小鼠模型中的工作强调，嘌呤能信号系统是皮质中失调的胶质信号通路。具体而言，P2Y2受体被证明在皮质星形胶质细胞上上调，但其在海马中是否受影响尚不清楚。本研究旨在启动这一检查。研究人员发现，P2Y2受体在出生后第21天（postnatal day 21，P21）的Fmr1-KO海马中表达增加，而在其他时间点未增加。研究人员确定，CA1星形胶质细胞和苔藓纤维束（mossy fibre tract）在很大程度上构成该上调的来源。在体外测量野生型（wild-type，WT）和Fmr1-KO星形胶质细胞的钙反应显示，与WT相比，更大比例的Fmr1-KO星形胶质细胞对P2Y2受体激动作用产生反应，且钙反应略大且持续时间略长，而峰值钙变化无差异。该研究证明Fmr1-KO海马中P2Y2信号存在发育性功能障碍，并强调胶质介导病理在FXS中的贡献。

研究背景与问题：脆性X综合征（Fragile-X Syndrome，FXS）是儿童智力障碍的主要遗传病因，由脆性X信使核糖核蛋白（fragile X messenger ribonucleoprotein，FMRP）缺失引起；FMRP是一种mRNA调控蛋白。海马与学习和记忆密切相关，因此FXS研究长期关注海马发育，但既往多聚焦神经元内在功能障碍。星形胶质细胞等胶质细胞在FXS海马中的潜在病理作用及分子机制仍不清楚。Fmr1^-/-（knockout，KO）小鼠模型研究提示，嘌呤能信号系统在皮质胶质细胞中失调，P2Y2受体在皮质星形胶质细胞上上调，但其是否影响海马尚不清楚。基于此，研究人员检验Fmr1-KO小鼠海马发育期P2Y2受体表达及星形胶质细胞功能，旨在明确嘌呤能信号是否参与FXS海马病理。

研究开展、结论和意义：研究人员比较P7、P14、P21及年轻成年（3–6个月）小鼠海马P2Y2表达，并在P21进行细胞定位和原代海马星形胶质细胞钙成像。结果显示，P2Y2仅在P21 Fmr1-KO海马显著升高，主要来源于CA1星形胶质细胞和苔藓纤维束；KO星形胶质细胞对P2Y2激动更敏感。该研究揭示Fmr1-KO海马P2Y2信号存在发育时点特异性功能障碍，强调胶质介导病理在FXS中的贡献，并为理解突触修剪期海马环路异常提供依据。

关键技术方法：研究使用Fmr1^-/-与WT小鼠，动物来源于McMaster Central Animal Facility和University of Guelph Central Animal Facility；WT为FVB.129P2[-Pde6b⁺ Tyrc-ch/AntJ]，Fmr1^-/-为FVB.129P2[-Pde6b⁺ Tyrc-ch] Fmr1fm1Cgr/J。取P7、P14、P21及3–6月龄海马，行定量Western blotting检测P2Y2；P21行免疫组织化学/免疫荧光，以GFAP、TUBB3、Iba1标记细胞并分析海马亚区共定位；取P0–P3原代海马星形胶质细胞，腺病毒转导GCaMP6m，活细胞钙成像检测ThioUTP、ATP及AR-C 118925XX反应。

研究结果：
1. P2Y2在P21海马中表达升高：定量Western blotting显示，P7和P14无基因型差异；P21 Fmr1-KO海马P2Y2显著高于WT（p=0.0023）；成年后差异消失；P21雌雄KO均高于同性别WT。结论：P2Y2上调具有P21发育时点特异性。
2. P2Y2与GFAP⁺星形胶质细胞共定位：免疫荧光显示P2Y2主要定位于GFAP⁺细胞；CA1的始群辐射层（stratum radiatum，SR）和腔隙分子层（stratum lacunosum moleculare，SLM）中KO共定位高于WT，CA3和齿状回（dentate gyrus，DG）无差异。结论：CA1星形胶质细胞贡献P2Y2上调。
3. P2Y2与TUBB3⁺神经元及苔藓纤维束：DG和CA1中P2Y2不与TUBB3⁺神经元胞体或突起共定位；CA3苔藓纤维束呈P2Y2阳性，且KO密度高于WT（p=0.0287）。结论：苔藓纤维束是P2Y2上调的另一来源。
4. P2Y2与Iba1⁺小胶质细胞共定位：P2Y2与Iba1⁺小胶质细胞共定位很低，CA1和CA3无共定位，DG仅少量共定位。结论：小胶质细胞不是主要来源。
5. 原代海马星形胶质细胞钙反应：钙成像显示，WT对ATP的总钙、持续时间和峰值均高于ThioUTP；KO中ATP与ThioUTP无显著差异；ThioUTP或ATP引起的总钙、持续时间和峰值无直接基因型差异；但KO对ThioUTP反应细胞比例约80%，高于WT约60%（p=0.0015），ATP在两种基因型均约99%细胞反应；AR-C几乎消除ThioUTP反应（0–10%），但不消除ATP反应。结论：KO海马星形胶质细胞对P2Y2激动更敏感，P2Y2激活可产生广泛钙反应。

讨论部分总结：
（1）P2Y2 dysregulation at P21 may disrupt a specific role of P2Y2 in development：P2Y2在海马发育中呈时间性表达，P5–15低、P20峰值、P25回落；成年P2Y2-KO小鼠海马活动增强、空间记忆下降、CA3-CA1长时程增强（long-term potentiation，LTP）增强、配对脉冲易化降低、谷氨酸释放增加，DG祖细胞增殖降低。星形胶质细胞中P2Y2经磷脂酶C（phospholipase C，PLC）–IP₃R2–Ca²⁺通路，与P2Y1相比产生更快钙反应；KO在P21表达升高可能干扰该未明发育作用。
（2）Purinergic-mediated astrocyte pathology in the Fmr1-KO hippocampus：皮质研究显示P2Y2上调增强星形胶质细胞钙活动及血小板反应蛋白1（thrombospondin 1，TSP-1）释放，促进突触生成和网络兴奋性；P2Y2抑制可正常化KO神经元爆发活动。CA1星形胶质细胞P2Y2升高可能经TSP-1增加突触；P21 CA1突触修剪减少，星形胶质细胞钙依赖性ATP释放经腺苷–A1受体限制时序依赖性长时程抑制（time-dependent long-term depression，t-LTD），P2Y2增强可能增加ATP释放并扰乱t-LTD与修剪。
（3）Neuronal purinergic dysregulation in the Fmr1-KO hippocampus：苔藓纤维束连接DG与CA3，P10建立并持续增厚至约P45；KO苔藓纤维束更宽、过度延伸至CA3锥体层、微小兴奋性突触后电流（miniature excitatory postsynaptic current，mEPSC）频率增加；P2Y2激活促进神经突生长和树突分支，可能参与增厚；P30差异消退与P2Y2表达正常化一致。
（4）Purinergic role in Fmr1-KO-associated cell stress and inflammation：KO脑存在细胞应激标志，包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）升高、抗氧化酶不足、线粒体功能障碍、蛋白稳态应激和自噬受损；KO皮质星形胶质细胞分泌Tenacin C和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6），信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）活化升高；IL-6升高可产生自闭症样表型；P2Y2参与STAT3磷酸化，可能介导IL-6相关效应。

研究结论（Conclusion）翻译：本研究为理解脆性X综合征中嘌呤能信号功能障碍，尤其是发育期海马区，提供了重要方面。研究结果突出出生后第21天P2Y2受体的变化，CA1星形胶质细胞和苔藓纤维神经元均显示P2Y2表达升高。海马在该时点经历若干在Fmr1-KO中受损的关键发育转变，如突触修剪峰值，提示P2Y2变化可能解释其中部分病理。海马星形胶质细胞对突触发育和功能至关重要，当FMRP缺乏时，其在P2Y2刺激下表现过度激活。根据皮质研究，研究人员知道这可导致突触因子过度分泌、炎症因子释放和细胞应激。进一步研究Fmr1-KO海马嘌呤能失调将有助于揭示嘌呤能信号和星形胶质细胞病理在FXS中可能发挥的动态作用。