《Giant》：Impact of bone age and anatomy, and of collagen self-assembly, on the stability towards thermal unfolding and on the renaturation capacity of mineralized bovine bone collagen solutions and films – Improving valorisation through variability elucidation
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胶原（collagen）是一种具有重要生物学和机械功能的结构蛋白。牛骨是矿化胶原（mineralised collagen）的首要来源，其中矿物组分（钙磷酸盐，calcium phosphates）赋予其额外性能。胶原已广泛用于生物材料，并持续揭示出多种前沿应
胶原（collagen）是一种具有重要生物学和机械功能的结构蛋白。牛骨是矿化胶原（mineralised collagen）的首要来源，其中矿物组分（钙磷酸盐，calcium phosphates）赋予其额外性能。胶原已广泛用于生物材料，并持续揭示出多种前沿应用。然而，在大规模层面，胶原仅从少数且标准化的来源中回收，而大部分物料流被损失。造成这一利用不足的主要原因之一是骨随生物学参数变化而产生的变异性，以及胶原对环境刺激的高度反应性。虽然这些因素可能阻碍骨资源化利用和胶原应用，但若被理解并加以调控，则可开发更符合期望的产品。因此，本研究旨在阐明牛骨骨龄（bone age，年轻/成年）和解剖部位（anatomy，股骨/胫骨）对与钙磷酸盐混合的胶原构象、胶原对热解折叠（thermal unfolding，25～85 °C）的反应性及其复性（renaturation）能力的影响；同时评估胶原自组装（self-assembly，纤维/胶囊）和胶原制剂形式（formulation，溶液/膜）的影响。研究采用同步辐射圆二色光谱（synchrotron radiation circular dichroism spectroscopy，SRCD），并通过化学计量学（chemometrics）探索样品变异性。主要聚类效应由制剂形式赋予，其次为骨解剖部位和胶原自组装。本研究是阐明若干生物学和技术因素对胶原解折叠和复性影响的开拓性方法。同时，本研究旨在强调动物骨分选的重要性，以确保胶原行为均一性、改善骨资源化利用并实现更有针对性的应用。
研究背景与目的：胶原（collagen）是结构蛋白，I型纤维状胶原应用广泛。牛骨是矿化胶原（mineralised collagen）的重要来源，其中钙磷酸盐（calcium phosphates）赋予其额外性能。但大规模利用受限：来源少且标准化，大部分料流仍用于低值用途；主要问题包括骨随生物学参数如骨龄（bone age）、解剖部位（anatomy）等变化，以及胶原对温度、pH等环境刺激高度反应。若理解并调控这些变异性，可开发差异化产品。因此，研究人员旨在阐明牛骨骨龄（年轻/成年）和解剖部位（股骨/胫骨）对与钙磷酸盐混合的I型胶原结构构象、热解折叠（thermal unfolding）稳定性及复性（renaturation）能力的影响，同时评估胶原自组装（self-assembly，纤维/胶囊）和制剂形式（formulation，溶液/膜）的作用。
关键方法：样本来自法国Auvergne-Rh?ne-Alpes当地屠宰场，雌性Holstein牛、有机养殖，同一年两次采集，每骨6个生物学重复；年轻4岁、成年7岁，取股骨和胫骨，未为该研究屠宰动物。按相同流程提取胶原-钙磷酸盐混合物，分别喷雾干燥（微胶囊）和冷冻干燥（纤维），再制成溶液和膜。采用同步辐射圆二色光谱（SRCD）在170～260 nm、25～85 °C（10 °C间隔，1 °C/min，三重复）采集加热及冷却回25 °C谱；热力学用Van’t Hoff、Gibbs和Gibbs-Helmholtz关系计算；用主成分分析（PCA）、凝聚层次聚类（AHC）和方差分析（ANOVA）评估变异性。
研究结果：
3.1 溶液中的结构构象及加热过程中的变化：研究人员用SRCD测椭圆率随温度及谱形，发现喷雾干燥粉末溶液中胶原主要呈变性游离三螺旋（triple-helix），随温度升高变性增强；FOSD和TYSD在≤65 °C折叠分数较高但冷却后复性较低，FYSD和TOSD复性较高；FOSD较高矿物/胶原比与蛋白聚糖（proteoglycans）含量可解释其较高热稳定和复性，TYSD矿物/胶原比最低且最变性。冷冻干燥粉末溶液也随温度解折叠，但复性程度总体更高；成年骨复性更高，成年股骨冷却后甚至比初始更折叠；冻干使胶原纤维化更接近天然骨组织构象。与无矿物的大鼠尾胶原标准品相比，牛骨胶原初始部分变性但复性更强，提示磷酸钙晶体参与复性。
3.2 膜的结构构象及加热过程中的变化：SRCD显示膜中胶原构象与溶液显著不同，椭圆率随温度不呈线性；存在游离螺旋、α-螺旋（α-helix）样和聚脯氨酸II（PPII）样螺旋。FOSD膜有α-螺旋正峰、PPII样连续负峰；FYSD的PPII样含量更高；TOSD类似年轻股骨；TYSD无α-螺旋正峰，提示变性游离三螺旋和PPII样。冻干粉末膜中年轻骨类似喷雾干燥膜；TYL含较多α-螺旋样、天然三螺旋和PPII样；成年FOL和TOL以无规卷曲（random coils）为主，TOL以PPII样为主。温度影响在冻干膜中较弱，但TYL随温度升高α-螺旋样和天然三螺旋增加；与大鼠尾胶原膜相比PPII样为主并见少量无规卷曲。结论：LiCl离子对破坏维持三螺旋的氢键（hydrogen bonds）和疏水相互作用（hydrophobic interactions），膜中螺旋构象异质性与序列有关。
3.3 样品聚类与变异性——骨龄和解剖部位、骨提取物干燥技术及制剂形式的影响：PCA/AHC对SRCD谱分析显示，主要聚类因素为制剂形式（溶液/膜），其次为骨解剖部位，再次为干燥技术/自组装；骨龄无显著影响，但随温度升高年龄影响更重要。喷雾干燥降低样品间变异，冷冻干燥允许更高复性。AHC在35 °C分两类，在85 °C分四类且类间方差更高，年龄影响增强。讨论分子机制涉及三螺旋、纤维、矿物及蛋白聚糖相互作用，并强调骨分选。
3.4 溶液的解折叠热力学：通过吉布斯自由能（ΔG）、焓（ΔH）、熵（ΔS）、热容变化（ΔC
p）和解折叠中点温度（T
M）计算，所有样品ΔG随温度增加；喷雾干燥溶液更明显，TOSD自约38 °C起呈非自发/可逆（正ΔG），65 °C后ΔG趋势变化；TOL和FOL分别最高和最低增加。ΔH为正，喷雾干燥溶液较高，提示极性基团暴露与水化更突出；ΔC
p除成年股骨FOSD/FOL外线性下降，提示极性残基暴露增加；FOSD在55～65 °C出现ΔC
p由负转正突变并对应T
M。ΔS为正但随温度下降，与极性基团水化增加一致。研究采用简化两态折叠模型。
讨论与结论：讨论汇总指出，胶原结构构象和热解折叠反应受所考察因素调控；排除制剂形式后，骨解剖部位是主要生物学变异因素，骨龄影响随温度升高而更重要；喷雾干燥降低变异，冻干提高复性；自组装影响解折叠驱动机制，喷雾干燥下更多极性基团暴露，提示氢键破坏相对疏水作用更显著；较高矿物和蛋白聚糖降低解折叠并提高复性；变异性可在原料骨层面（上游）和提取胶原处理层面（下游）调控；强调骨分选对高效资源化利用的重要性。
研究结论翻译：胶原的结构构象及其对解折叠的热反应受到所考察因素的调控。当排除制剂形式（溶液或膜）的影响时，骨的解剖部位是主要生物学变异因素，这证实了先前关于按年龄和解剖部位进行骨聚类的研究。然而，骨龄的影响随温度升高而变得更加重要。喷雾干燥降低了变异性，但冷冻干燥允许更高程度的胶原复性。胶原自组装也对胶原解折叠的驱动机制产生显著影响。在喷雾干燥情况下，更多极性基团暴露；这表明相对于冷冻干燥，氢键破坏较疏水相互作用更为显著。较高的矿物质和蛋白聚糖含量降低了去折叠并允许更高的重折叠。因此，本研究结果揭示，尽管胶原热行为存在一定程度变异性，但该变异性可在上游即原料（骨）层面以及下游即通过提取胶原的不同处理进行调控。最终，本研究强调了骨分选的重要性，以实现这一宝贵纤维状胶原来源更有效的资源化利用途径。
