KDAC8失活致cohesin去乙酰化缺失引发cohesin复合物表达改变与染色体不稳定性

《PLOS One》：Loss of cohesin deacetylation through KDAC8 inactivation leads to altered cohesin complex expression and chromosomal instability

　　

cohesin复合物对于基因的正确表达以及在有丝分裂过程中姐妹染色单体的配对以确保染色体正确分离均至关重要。SMC3（cohesin复合物的一个组成亚基）的乙酰化和去乙酰化是控制该复合物稳定性与再形成的关键调控机制。研究人员在Cornelia de Lange综合征（CdLS）患者中观察到cohesin相关基因存在突变，其中包括赖氨酸去乙酰化酶KDAC8（HDAC8）的突变，这些突变导致复合物形成与再循环的破坏。为进一步理解SMC3乙酰化循环被破坏后的细胞学后果，研究人员利用了KDAC8被催化失活变体（8CDm）替换或敲除（8KO）的细胞系。尽管8CDm细胞系完成有丝分裂的速率与野生型细胞相同，但8CDm细胞表现出严重的染色体不稳定性（CIN），其特征为微核增多以及存在显著的循环性四倍体细胞亚群。这些缺陷在8KO细胞中未被观察到。虽然所有细胞系中SMC3总蛋白水平相似，但SMC3及其他cohesin相关基因在突变细胞系中存在差异表达。研究人员提出一个模型：8KO细胞通过同时提高SMC3的周转率和基因表达来补偿无法对SMC3去乙酰化的缺陷，而8CDm介导的SMC3周转率与表达抑制导致功能性cohesin复合物减少，从而产生严重的染色体不稳定性表型。总体而言，这些观察结果加深了对KDAC8介导SMC3去乙酰化重要性的理解，并为Cornelia de Lange综合征患者中观察到的表型多样性提供了见解。

论文解读

一、研究背景与科学问题

基因组组织的正确维持对细胞功能至关重要，cohesin复合物在这一过程中发挥核心作用。cohesin是由SMC1A、SMC3、Rad21和STAG1/2组成的多蛋白环状复合物，在间期负责维持染色质空间组织以调控基因表达，在S期和有丝分裂期负责将姐妹染色单体配对以确保正确分离。SMC3的乙酰化/去乙酰化循环是调控cohesin复合物稳定性与再形成的关键机制：SMC3在K105和K106位点被乙酰转移酶ESCO1和ESCO2乙酰化，这一修饰对姐妹染色单体 cohesion 至关重要；而KDAC8（HDAC8）负责对释放后的乙酰化SMC3进行去乙酰化，使其能够被回收利用进入新的cohesin复合物。

Cornelia de Lange综合征（CdLS）是最常见的cohesin病，患者中已发现包括KDAC8在内的多个cohesin相关基因突变。已有证据表明，携带KDAC8突变的CdLS患者细胞在多次传代后积累染色体畸变，且KDAC8敲除小鼠表现出围产期致死和颅骨形成缺陷。然而，KDAC8活性丧失与染色体稳定性之间的直接联系及其分子机制尚未明确。此外，此前研究多依赖化学抑制剂研究KDAC8功能，但现有抑制剂特异性和效力不足，存在脱靶效应，难以清晰解析KDAC8的功能。

基于上述问题，研究人员此前利用CRISPR/Cas9技术在HT1080细胞中构建了KDAC8催化失活突变体（8CDm，KDAC8^H143A）细胞系，并发现该细胞系中超过八千个基因差异表达，涉及有丝分裂、DNA修复、转录和翻译等多个过程。本研究在此基础上进一步构建了KDAC8完全敲除（8KO）细胞系，系统比较两种细胞系的表型差异，旨在阐明KDAC8催化活性丧失与染色体不稳定性之间的因果关系及分子机制。

二、主要关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建KDAC8敲除（8KO）细胞系，与前期构建的催化失活（8CDm）细胞系进行比较；采用流式细胞术分析细胞周期分布和DNA含量；运用荧光显微镜和免疫荧光技术检测细胞核形态异常（多核细胞、微核）及SMC3和乙酰化SMC3（acSMC3）的表达与定位；通过免疫印迹检测KDAC8、SMC3、acSMC3等蛋白表达水平；利用活细胞成像技术追踪单个细胞有丝分裂和胞质分裂的时序；采用RNA-seq转录组分析和基因本体论（GO）分析比较不同细胞系中cohesin相关基因的表达变化。细胞系均来源于HT1080人纤维肉瘤细胞。

三、研究结果

1. 核内乙酰化SMC3与SMC3比值在KDAC8失活和敲除细胞中相似

研究人员利用CRISPR/Cas9方法构建了8KO细胞系，与8CDm细胞系一样经过近三个月的长期培养以模拟长期适应状态。免疫印迹和免疫荧光结果显示，8KO细胞中完全检测不到KDAC8蛋白表达，8CDm和8KO细胞中acSMC3水平均显著升高，两种突变细胞系核内acSMC3与SMC3的比值约为野生型细胞的100倍，而总SMC3蛋白水平在三种细胞系中保持一致。

2. KDAC8催化活性遗传失活导致染色体不稳定性增强

通过对固定细胞进行DAPI染色和荧光显微镜分析，研究人员发现8CDm细胞中多核细胞比例较野生型增加超过5倍，含微核细胞比例增加超过6倍，且核面积更大、异质性更强。流式细胞术分析显示，8CDm细胞系出现2n、4n和8n三个明显的DNA含量峰，其中4n峰为最大峰，且大部分4n细胞为单核G1期四倍体细胞，表明存在活跃循环的四倍体细胞亚群。相比之下，8KO细胞的流式细胞术图谱与野生型细胞无明显差异，微核频率和核面积也无显著变化，未表现出严重的染色体不稳定性表型。

3. KDAC8失活细胞尽管存在染色体不稳定性但细胞分裂时序未改变

活细胞成像追踪单个细胞有丝分裂事件的结果显示，三种细胞系在完成有丝分裂（从细胞变圆到中间体形成）和胞质分裂（从中间体形成到分裂完成）所需时间上均无显著差异，也未观察到细胞分裂失败形成多核细胞的事件。细胞生长速率分析表明，仅8CDm细胞系的每日倍增次数较野生型显著减少，提示部分8CDm细胞可能停止分裂或分裂频率降低，但大部分四倍体细胞仍在活跃增殖。

4. KDAC8催化失活或敲除导致cohesin相关基因的差异性表达变化

RNA-seq和GO分析显示，8KO细胞系中与细胞周期相关的基因表达变化仅涉及“细胞周期调控”的上调，而8CDm细胞系中则涉及多个与有丝分裂和胞质分裂相关的GO条目下调。进一步针对cohesin相关基因的分析发现，8CDm细胞中SMC3、Rad21、STAG2等cohesin环核心组分的基因表达下调，ESCO2（负责姐妹染色单体cohesion所需的SMC3乙酰化）和NIPBL（负责cohesin装载到DNA上）等促进cohesin-DNA结合和稳定的蛋白基因也下调；而8KO细胞中SMC3基因表达上调，SMC1A和STAG2也有较小幅度的上调。两种细胞系在cohesin相关基因表达方向上呈现截然不同的模式。

四、讨论与结论

研究人员提出一个工作模型来解释两种突变细胞系表型的差异：在8KO细胞中，由于KDAC8缺失导致acSMC3无法被去乙酰化回收，细胞通过上调SMC3基因表达并增加蛋白降解速率来补偿无法回收的acSMC3，从而维持足够的未乙酰化SMC3供给cohesin复合物组装，因此表型相对温和。而在8CDm细胞中，催化失活的KDAC8蛋白仍能结合acSMC3但无法催化去乙酰化反应，可能通过封闭降解起始位点等方式阻止acSMC3的降解，细胞为维持总SMC3水平恒定而下调SMC3基因表达，导致游离未乙酰化SMC3池不足，加之其他cohesin组分和促进复合物形成的蛋白表达下调，最终导致功能性cohesin复合物减少，经过多轮细胞分裂后累积染色体分离错误，产生严重的染色体不稳定性表型。

该研究结论为：KDAC8通过其SMC3去乙酰化功能在维持染色体稳定性中发挥重要作用。催化失活的KDAC8（8CDm）通过改变SMC3周转率和cohesin复合物丰度导致严重染色体不稳定性，而KDAC8完全缺失（8KO）时细胞可通过补偿机制维持相对正常的表型。这一发现解释了为何CdLS患者中KDAC8错义突变有时比完全缺失导致更严重的疾病表现，提示SMC3周转和cohesin复合物丰度的改变可能贡献于疾病严重程度，染色体不稳定性也可能是CdLS疾病进展中的重要因素。