圆鳍鱼（Cyclopterus lumpus）头肾与鳃对杀鲑弧菌（Moritella viscosa）感染的转录组响应

《Fish & Shellfish Immunology》：Transcriptomic response of the head kidney and gill of lumpfish ( Cyclopterus lumpus) to Moritella viscosa infection.

　　

中文翻译 在圆鳍鱼（Cyclopterus lumpus）中建立了一种系统性杀鲑弧菌（Moritella viscosa）感染模型。M. viscosa 的中位致死剂量（LD50）为 8.1 × 107 CFU dose-1。RNA-seq 在感染后第 10 天（10 dpi）分别鉴定出头肾和鳃中的 731 个和 217 个差异表达基因（DEGs）。头肾的响应涉及急性炎症，而鳃的响应则涉及补体系统和细胞外基质（ECM）重塑。该研究首次提供了圆鳍鱼对 M. viscosa 感染响应的转录组特征描述。

论文解读文章

一、研究背景与目的

圆鳍鱼（Cyclopterus lumpus）长期以来被用作大西洋鲑（Salmo salar）养殖中海虱（Lepeophtheirus salmonis）生物防治的清洁鱼，以减少对化学治疗药物的依赖。尽管近年来其在挪威等地的使用量因除虱效果不稳定、高死亡率和福利问题而显著下降，但圆鳍鱼的健康与传染病问题仍具重要性。圆鳍鱼易感多种传染性病原体，细菌性疾病在其养殖和投入鲑鱼养殖过程中构成重要挑战，已报道的病原包括巴氏杆菌属（Pasteurella spp.）、鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）、鳗败血假单胞菌（Pseudomonas anguilliseptica）、杀鲑弧菌（Moritella viscosa）等。由于圆鳍鱼与大西洋鲑在海笼中共养的历史，其病原易感性还涉及两种鱼之间病原交换的生物安全风险。

M. viscosa 是一种革兰氏阴性、嗜冷海洋细菌，是冬季溃疡病的主要病原，该病影响多种冷水海洋鱼类，尤其在北极大西洋养殖大西洋鲑中研究较为充分，暴发通常与低于 10°C 的低海水温度相关，可导致死亡、福利下降和经济损失。M. viscosa 宿主范围广泛，除大西洋鲑外还可感染虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、鲽（Pleuronectes platessa）、圆鳍鱼、黑线鳕（Melanogrammus aeglefinus）、大西洋庸鲽（Hippoglossus hippoglossus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）和大西洋鳕（Gadus morhua）。已有研究表明圆鳍鱼对 M. viscosa 易感，但与大西洋鲑相比，圆鳍鱼冬季溃疡病的发病机制和免疫应答仍缺乏系统研究。特别是感染过程中主要黏膜和系统性免疫组织的分子响应此前未被定义，这是本研究旨在填补的重要知识空白。

近年来，圆鳍鱼的转录组研究已开始表征对杀鲑气单胞菌、鳗弧菌、鲑肾杆菌（Renibacterium salmoninarum）以及 poly(I:C) 等病毒模拟物的分子响应，揭示了组织、病原和感染阶段特异性的转录和免疫响应。鳃作为与水生环境接触的主要黏膜界面，除气体交换、渗透调节等功能外，是水生病原体免疫监视和防御的重要部位；头肾则是含有丰富淋巴细胞和髓系细胞群体的主要系统性免疫和造血器官。鉴于圆鳍鱼对 M. viscosa 的易感性，感染过程中鳃和头肾的转录响应此前尚未被研究。研究人员假设这两个功能不同的组织会对 M. viscosa 感染表现出不同的转录响应，并通过 RNA-seq 分析在感染后第 10 天（10 dpi）对头肾和鳃进行转录组-wide 分析加以验证。

二、主要技术方法

研究人员建立了 M. viscosa J311（ATCC BAA-105）系统性感染模型。实验鱼（体重 25.8 ± 6.60 g）来自纽芬兰纪念大学 Joe Brown 水生研究楼（JBARB），在 500 L 水箱中于 10 ± 1°C 过滤紫外线处理海水中饲养。通过腹腔注射（i.p.）三种剂量（3.1 × 10⁶、3.1 × 10⁷ 和 3.1 × 10⁸ CFU dose^-1）确定 LD₅₀，并在 5、10 和 15 dpi 通过平板稀释法测定血液、鳃、肝、脾和头肾中的细菌载量。组织病理学检查采用苏木精-伊红（H&E）染色。转录组分析在 10 dpi 进行，取感染组（3.1 × 10⁶ CFU dose^-1）和对照组各 3 条鱼的头肾和鳃组织，构建 12 个 cDNA 文库，使用 Illumina NovaSeq 6000 平台进行 100 bp 双端测序。数据使用 CLC Genomics Workbench v22.0 分析，比对到圆鳍鱼参考基因组（GCF_009769545.1），以 FDR ≤ 0.05 和 |log₂ fold change| ≥ 1 为阈值鉴定差异表达基因（DEGs）。GO 富集分析使用 ClueGO 和 CluePedia 插件在 Cytoscape 中进行。RT-qPCR 用于验证 13 个 DEGs 的表达模式。

三、研究结果

3.1 M. viscosa LD₅₀ 与圆鳍鱼系统性感染

研究人员通过腹腔注射三种剂量的 M. viscosa J311 评估其致病性。高剂量（3.1 × 10⁸ CFU dose^-1）感染鱼在 3 dpi 死亡率达 65%，最终累积死亡率为 66.67%；中剂量（3.1 × 10⁷ CFU dose^-1）和低剂量（3.1 × 10⁶ CFU dose^-1）在 30 dpi 的累积死亡率分别为 48.39% 和 30.51%。计算得出的 LD₅₀ 为 8.1 × 10⁷ CFU dose^-1。感染鱼出现嗜睡、食欲丧失、游动异常、突眼、体色变暗、尾鳍出血、腹部膨胀和坏死性皮肤病变等临床症状。细菌载量测定显示，各剂量组感染鱼的头肾中均未检出细菌，而多数感染鱼在 15 dpi 时鳃中细菌载量较高，提示鳃可能是 M. viscosa 的优先定植部位。

3.2 组织病理学分析

组织病理学检查显示，感染鱼在 5 和 10 dpi 时肝、脾、头肾和鳃均出现明显损伤、坏死和出血。鳃组织在 5 和 10 dpi 均显示鳃小片上皮细胞坏死和变性，10 dpi 时鳃小片中可见细菌存在。肝脏在 5 和 10 dpi 出现严重坏死和空泡化。头肾在 5 dpi 出现血细胞聚集、坏死和颗粒样变化。脾脏在 5 dpi 显示大量血细胞聚集、出血和坏死，10 dpi 时出现大量坏死、变性和核固缩细胞。

3.3 转录组测序与读段比对

RNA-seq 共生成 12 个 cDNA 文库，每个文库产生约 78.5–478.9 百万条原始读段，平均读长 101 bp。质量修剪保留了 98.1–98.9% 的原始读段，比对到圆鳍鱼参考基因组（GCF_009769545.1）的效率为 80.06%–93.46%。原始数据已提交至 NCBI SRA（BioProject 登录号 PRJNA1023856）。

3.4 头肾和鳃的差异基因表达分析

主成分分析（PCA）和层次聚类显示感染组与对照组在两种组织中均明显分离。差异表达分析鉴定出头肾中 731 个 DEGs，鳃中 217 个 DEGs。两种组织共享 41 个 DEGs（22 个上调，19 个下调），其余大部分 DEGs 为组织特异性。头肾的转录变化数量远大于鳃，且两者重叠有限，表明系统性 M. viscosa 感染引发组织特异性转录响应。

3.5 头肾 DEGs 的 GO 富集分析

头肾上调 DEGs 富集于免疫和炎症相关过程，包括急性炎症反应、急性期反应、受体-配体活性、对细菌和细胞因子刺激的响应、MAP 激酶磷酸酶活性、激素代谢过程调节、脂质定位、骨吸收和糖皮质激素响应等。上调基因包括 α-2-巨球蛋白样转录本、adam8a、adamts1、timp2b 等金属肽酶相关基因。头肾下调 DEGs 富集于转运和代谢功能，包括有机阴离子和寡肽转运、ABC 型转运体活性、水解酶活性、氨基酸和单羧酸代谢、受体-配体活性、胰岛素样生长因子结合等，涉及 meprin、氨肽酶和羧肽酶相关转录本。

3.6 鳃 DEGs 的 GO 富集分析

鳃上调 DEGs 主要富集于补体激活和补体激活调节、细胞外渗、白细胞锚定或滚动等免疫和炎症过程。补体相关基因包括 c6、c7a 和 cd59a，细胞外渗和白细胞滚动相关基因包括 selp 和 E-选择素样转录本。还检测到肉碱代谢过程、岩藻糖结合和高密度脂蛋白颗粒相关功能的富集。鳃下调 DEGs 富集于抗体依赖性细胞毒性、II 型超敏反应调节、免疫球蛋白结合、抗原加工呈递，以及纤维状胶原三聚体和胶原相关组分，多个胶原转录本（包括 col2a1b 和胶原样 LOC 转录本）表达下降。

3.7 RT-qPCR 验证

研究人员选取头肾 7 个和鳃 6 个显著 DEGs 进行 RT-qPCR 验证。所有引物对均产生单一熔解峰，无非特异性扩增。RT-qPCR 结果与 RNA-seq 表达趋势一致：头肾中 LOC117741394 和 LOC117728096 上调，LOC117746324、LOC117734812 和 ca4a 下调；鳃中 mrc1b 和 si:ch73-86n18.1（cldc1）上调，LOC117733376、ncam3 和 LOC117726003 下调。

四、讨论与结论

本研究表明，腹腔注射 M. viscosa 可建立圆鳍鱼系统性感染模型，疾病严重程度与攻击剂量密切相关。LD₅₀ 为 8.1 × 10⁷ CFU dose^-1，表明在当前腹腔注射条件下需要相对较高的细菌剂量才能产生 50% 死亡率。LD₅₀ 值应主要解释为当前实验条件下圆鳍鱼的剂量-死亡率关系，而非物种易感性的绝对度量。

头肾和鳃在细菌回收、组织损伤和转录调控方面表现出显著差异。头肾作为主要系统性免疫器官，在 10 dpi 时表现出以急性炎症和急性期反应为主的广泛转录响应，涉及急性期蛋白（如血清淀粉样蛋白 A、hepcidin）、促炎细胞因子（如 IL-6、IL-17C、IL-1β）、金属肽酶及其抑制剂等。鳃作为黏膜屏障组织，其响应以补体激活、白细胞募集和 ECM 重塑为特征，补体成分（C6、C7、CD59）和选择素（P-选择素、E-选择素）上调，而多个胶原基因下调，提示感染导致的组织损伤和 ECM 降解。

该研究首次提供了圆鳍鱼对 M. viscosa 感染响应的转录组特征描述，揭示了系统性免疫器官和黏膜/屏障组织在感染过程中不同的分子响应模式，为理解圆鳍鱼冬季溃疡病的组织特异性发病机制提供了框架，并可能为未来疾病预防和控制研究奠定基础。