基于GC-MS与LC-MS整合代谢组学的狗牯脑茶等级化学差异及其抗氧化活性研究

《Food Chemistry: X》：Integrated GC–MS and LC–MS metabolomics reveals grade-dependent chemical variation and antioxidant activity of Gougunao tea

　　

专业译文 本研究采用整合顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）与超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-QE-Orbitrap-HRMS）的代谢组学策略，结合化学计量学分析，对六个商业等级的狗牯脑茶（GT）进行了挥发性及非挥发性代谢物差异表征。利用DPPH、ABTS及铁离子还原抗氧化能力（FRAP）三种互补性体外试验评估了不同等级GT样品的抗氧化活性，并通过相关性分析筛选与抗氧化潜力相关的代谢物。结果显示，共鉴定出137种挥发性化合物和328种非挥发性特征代谢物，其中醇类、醛类和酮类是主要的挥发性类别，而脂肪酸衍生物、黄酮类、氨基酸及肽类则是常见的非挥发性成分。主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型清晰区分了六个等级，表明非挥发性代谢物提供了更显著的等级关联分离信息。经初步筛选，共有81个特征被确定为候选等级关联标志物，包括31种挥发性物质（如1-戊烯-3-醇、环萜烯、芳樟醇）和50种非挥发性代谢物（如咖啡因、茶氨酸、表没食子儿茶素）。所有GT样品均表现出强抗氧化活性，其DPPH半数抑制浓度（IC50）值（4.50–5.78 μg/mL）和ABTS IC50值（6.79–9.30 μg/mL）均低于阳性对照L-抗坏血酸（LAA）。斯皮尔曼相关性分析显示，多种黄酮类化合物（如(-)-儿茶素没食子酸酯、芦丁和表没食子儿茶素）与抗氧化能力呈正相关，提示它们是潜在的抗氧化活性贡献代谢物。本研究首次全面描绘了GT商业等级间的代谢组学图谱，为理解其品质差异和功能价值提供了化学依据。

论文解读文章

研究背景与目的

茶叶作为全球消费最广泛的饮料之一，其感官品质由生长、采摘及加工过程中形成的复杂挥发性和非挥发性代谢物共同决定。此外，茶叶因其抗氧化、抗炎等生物活性而备受关注。狗牯脑茶（Gougunao tea, GT）是中国江西省遂川县的一种著名地理标志绿茶，拥有超过200年的饮用历史。根据中国国家标准GB/T 19691–2008，GT被划分为特级珍品、特级贡品、特级极品、特级、一级和标准级六个商业质量等级。尽管此前研究表明，不同等级绿茶和乌龙茶的代谢物存在显著差异，但GT各等级间潜在的化学成分差异尚未得到系统研究。同时，虽然已有研究应用整合的气相色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）代谢组学方法区分不同产地的GT，但针对等级依赖的化学变异及其与抗氧化活性的关系仍属空白。因此，本研究的目的是利用整合的顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）和超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-QE-Orbitrap-HRMS）代谢组学策略，结合化学计量学分析，系统表征六个商业等级GT的挥发性及非挥发性代谢物差异，评估其抗氧化活性，并探索代谢物与抗氧化能力的潜在关联，从而为GT的品质评价和功能价值提供全面的化学证据。

主要关键技术方法

研究人员从江西洪露茶业有限公司获取了六个商业等级的GT样品（G1至G6），所有样品均采自2024年同一茶园。对于挥发性代谢物分析，采用HS-SPME-GC-MS技术，使用DB-Wax毛细管柱进行色谱分离，质谱采用电子轰击电离模式，化合物通过与NIST 23质谱库比对及线性保留指数匹配进行鉴定。对于非挥发性代谢物分析，采用75%甲醇超声提取后，利用UPLC-QE-Orbitrap-HRMS在正负离子模式下进行数据采集，代谢物注释基于自建的BiotreeDB 3.0标准品数据库，采用MetDNA2评分策略进行严格匹配。抗氧化活性通过DPPH自由基清除、ABTS阳离子自由基清除和铁离子还原抗氧化能力（FRAP）三种互补性体外试验进行评估。统计分析方法包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、单因素方差分析和斯皮尔曼相关性分析。

研究结果

3.1 基于HS-SPME-GC-MS代谢组学的GT样品挥发性轮廓

通过HS-SPME-GC-MS非靶向代谢组学，研究人员在六个等级的GT中共鉴定出137种挥发性化合物，分属于17个化学类别，包括醇类、醛类、酮类、酯类和单萜类等。其中，醇类是含量最丰富的类别，占总挥发物的25.45%–33.72%，其次是醛类（17.91%–21.45%）和酮类（6.70%–9.50%）。在单个化合物中，1-戊烯-3-醇是最主要的挥发性成分，相对含量范围为8.38%–20.10%。这些结果表明GT挥发物具有高度的化学复杂性。

3.2 基于UPLC-QE-Orbitrap-HRMS代谢组学的GT样品非挥发性轮廓

通过UPLC-QE-Orbitrap-HRMS非靶向代谢组学，研究人员共获得4388个具有数据依赖性采集二级质谱信息的独特分析特征。经过严格的鉴定标准筛选，最终注释了328个分析特征，其中包括288个MSI一级鉴定和40个未分辨的异构体特征。这些特征归属于20个化学类别，主要包括脂肪酸及其衍生物（70个特征）、黄酮类（42个）、氨基酸及肽类（37个）、甘油磷脂类（33个）和核苷酸及其衍生物（23个）。这揭示了GT非挥发性代谢组的显著化学多样性。

3.3 化学计量学分析揭示GT的等级依赖性化学变异

为了评估各等级间的代谢差异，研究人员对挥发性及非挥发性代谢组数据集分别进行了PCA和PLS-DA分析。在PCA模型中，前两个主成分解释了总方差的50%以上。PLS-DA模型则显示出清晰的分离模式，模型参数R²X(cum)、R²Y(cum)和Q²(cum)均超过0.83，且排列检验表明模型未过拟合。对于挥发性代谢物，中间等级（G2、G3、G4）聚类较近，而高低等级样品分离明显。相比之下，非挥发性代谢物在所有六个等级间均形成了明显的聚类，表明其为等级区分提供了更丰富的信息。

3.4 GT中的初步等级关联候选代谢物

为了阐明等级分离的化学基础，研究人员根据PLS-DA模型中的变量重要性投影（VIP）值大于2.0和单因素方差分析p值小于0.05的联合标准，初步筛选出81个等级关联候选代谢物，包括31种挥发性化合物和50种非挥发性代谢物。在挥发性候选物中，1-戊烯-3-醇（VIP=6.74）、环萜烯（5.84）、戊醛（5.44）、苯乙醇（4.43）和芳樟醇（4.21）贡献最大。在非挥发性候选物中，正离子模式下咖啡因（9.77）、茶氨酸（7.53）、亚油酰胺（6.02）等排名靠前；负离子模式下4-对香豆酰奎宁酸（6.64）、原花青素B2（5.75）等VIP值最高。热图分析显示，一些代谢物呈现出随等级降低而增加或减少的趋势，例如茶氨酸随等级降低总体下降，而表没食子儿茶素和(+)-没食子儿茶素则总体上升，这可能反映了不同等级鲜叶成熟度的差异。

3.5 GT样品的抗氧化活性评估

研究人员采用DPPH、ABTS和FRAP三种方法评估了GT样品的抗氧化活性。所有GT样品均表现出强的自由基清除能力。在50 μg/mL终浓度下，DPPH抑制率均超过84%，ABTS抑制率在74%–82%之间。DPPH IC₅₀值范围为4.50–5.78 μg/mL，ABTS IC₅₀值范围为6.79–9.30 μg/mL，均低于阳性对照L-抗坏血酸（分别为7.88和13.63 μg/mL）。FRAP测定显示所有样品均呈现浓度依赖性的铁离子还原能力。值得注意的是，抗氧化活性与商业等级顺序并不一致，表明抗氧化能力并非直接由商业质量等级决定。

3.6 代谢物与抗氧化潜力的关联分析

为了探索代谢物变异与抗氧化活性之间的关系，研究人员对等级关联的非挥发性代谢物与三项抗氧化指标进行了斯皮尔曼相关性分析。结果显示，多种黄酮类化合物，如(+)-没食子儿茶素、(-)-儿茶素没食子酸酯、芦丁和表没食子儿茶素，与抗氧化能力呈正相关，暗示它们可能是潜在的抗氧化活性贡献者。相反，咖啡因等生物碱与抗氧化指标呈负相关。然而，由于样本量有限（n=6），大多数相关性未达到统计学显著性，这些结果应视为探索性和假设生成性质的。

结论与意义

本研究首次利用整合的HS-SPME-GC-MS和UPLC-QE-Orbitrap-HRMS代谢组学策略，系统揭示了六个商业等级GT的等级依赖性化学变异和抗氧化活性。共表征了137种挥发性化合物和328种非挥发性特征代谢物，展示了这种区域绿茶的显著化学多样性。多变量分析揭示了等级相关的代谢差异，表明挥发性和非挥发性谱图为等级区分提供了互补的化学信息。初步筛选出81个候选等级关联特征，其中1-戊烯-3-醇、咖啡因、茶氨酸、表没食子儿茶素、原花青素B2及几种儿茶素相关化合物是突出的候选物。所有GT样品均表现出强抗氧化活性，其DPPH和ABTS IC₅₀值低于LAA，FRAP值高于LAA。探索性相关性分析进一步显示，(-)-儿茶素没食子酸酯、芦丁和表没食子儿茶素等多种黄酮类化合物与抗氧化能力呈正相关，表明它们是潜在的抗氧化活性候选代谢物。总之，这项工作为GT商业等级间的化学分化提供了全面的代谢组学证据。未来涉及靶向定量、独立样本验证及候选代谢物实验验证的研究将进一步阐明它们与GT品质和抗氧化活性的关系。