# 论文标题 负载睡茄（*Withania somnifera* (L.) Dunal）根提取物的多功能壳聚糖纳米载体：理化表征与生物活性

《Food Hydrocolloids for Health》：Multifunctional Chitosan Nanocarriers Loaded with Withania somnifera (L.) Dunal Root Extract: Physicochemical Characterization and Biological Activities

　　

# 摘要翻译

睡茄（Ashwagandha）是一种具有多种药理特性的药用植物；然而，其生物活性成分的治疗应用常受限于水溶性差和生物利用度低。本研究旨在开发负载睡茄根提取物的壳聚糖基纳米粒（Ashwa-Chit NPs），并评估其理化特征与生物活性，与相应睡茄根提取物水溶液（Ashwa-Aqua）进行比较。Ashwa-Chit NPs经离子凝胶法制备，并采用ζ电位分析、透射电子显微镜（TEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）及体外释放研究进行表征。该纳米粒呈球形形态，平均粒径为34.15 ± 6.53 nm，ζ电位为+31.5 mV（正值），提示具有良好的胶体稳定性。气相色谱–质谱（GC–MS）分析鉴定出44种植物化学成分，包括脂肪酸衍生物、萜类相关化合物、含氧代谢物及酚类成分。该纳米制剂在酸性条件下表现出持续释放行为，16 h后累积释放率达74.9%。生物活性测定显示，两种制剂均具有显著的抗氧化、抗炎、抗菌及抗增殖活性。Ashwa-Aqua表现出更优的抗氧化活性、对HeLa细胞最强的细胞毒作用（IC₅₀ = 18.11 ± 1.4 μg/mL）以及最高的抗菌活性，尤其对*Candida albicans*。相反，Ashwa-Chit NPs对脂多糖（LPS）刺激的A549细胞中促炎细胞因子IL-6和TNF-α的抑制作用最强，提示其抗炎效能增强。尽管纳米包封并未改善全部生物活性，但其在保留提取物生物活性的同时选择性增强了抗炎性能。上述结果表明，睡茄根提取物具有多功能生物活性，壳聚糖基纳米包封是用于植物化学成分控释递送及生物响应调控的有前景策略。所开发的纳米制剂或可为未来药学与生物医学应用提供有用工具。

# 论文主体解读

## 一、研究背景与立项依据

睡茄（*Withania somnifera* (L.) Dunal，俗称Ashwagandha、印度人参）为茄科（Solanaceae）多年生药用小灌木，其根在阿育吠陀医学中被归为Rasayana类制剂，传统用于增强活力、延年益寿及抵御疾病。睡茄具有抗氧化、抗炎、免疫调节、神经保护、抗菌及抗癌等多谱生物活性，这些特性归因于睡茄内酯（withanolides）、生物碱、酚类化合物及黄酮类等多样生物活性代谢物。然而，其活性成分的临床转化受制于水溶性差、易降解、代谢迅速及由此导致的生物利用度低；传统提取物制剂药代动力学特征变异大、组织分布缺乏特异性，常需更高剂量方能奏效，从而增加脱靶效应风险。纳米技术递送系统因而被视为克服植物源活性成分理化与药代动力学障碍的有力平台，其中聚合物纳米粒具备纳米尺度、高比表面积、可控降解、增强细胞相互作用及持续释放等优势。壳聚糖纳米粒因低毒性、生物相容性、可生物降解性、黏膜黏附性及阳离子特性（可与带负电的生物分子和细胞膜发生静电作用）而备受关注。

研究人员指出既往研究存在以下知识空白：其一，理化表征与生物性能数据整合不足，难以建立结构–活性关系；其二，酸性条件（如实体瘤微环境，以及壳聚糖纳米粒的pH响应性溶胀与溶解行为）下的释放行为研究匮乏；其三，GC–MS等植物化学成分谱分析与生物活性评价结合不紧密，难以识别发挥药效的具体成分及其协同作用；其四，对关键促炎介质白细胞介素-6（IL-6）与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）调控作用的机制研究不足，而炎症在肿瘤发生发展中居核心地位。

据此，本研究采用温和、可放大、无溶剂的离子凝胶法制备负载睡茄根提取物的壳聚糖纳米粒（Ashwa-Chit NPs），系统评价其粒径、ζ电位、形貌与FTIR光谱特征等理化性质，通过GC–MS分析植物化学成分，考察酸性条件下的释放行为，并评价抗氧化、抗菌、抗炎与抗癌等多重生物活性；同时以睡茄根提取物水溶液（Ashwa-Aqua）及空白壳聚糖纳米粒（Chit NPs）为对照，以区分源于被包封植物化学成分的效应与源于载体基质本身的效应。据现有文献，尚无研究在同一实验框架内同时整合上述多维评价。

## 二、关键技术方法

研究以埃及亚历山大省Borg El Arab采集并经鉴定的睡茄健康根（凭证标本号ALEX 4122，存放于亚历山大大学植物标本馆）为材料，经96%乙醇浸提、减压浓缩及冻干制得乙醇提取物（Ashwa-E），并复溶制备10%（w/v）水溶液（Ashwa-Aqua）。以低分子量壳聚糖（50–190 kDa，脱乙酰度85%）与三聚磷酸钠（TPP）经离子凝胶法制备Chit NPs及Ashwa-Chit NPs；采用Zetasizer测定粒径分布与ζ电位，TEM观察形貌与粒径，FTIR（KBr压片法，4000–500 cm^?1）表征官能团。于pH 4.5的磷酸盐缓冲液（PBS）中37°C进行体外释放研究，270 nm紫外–可见分光光度法测定累积释放率。以气相色谱–质谱联用（GC–MS，NIST库比对）分析植物化学成分。生物活性评价包括：DPPH自由基清除法测抗氧化活性（以抗坏血酸为参照）；MTT法测对A549、HeLa、HCT-116、MCF-7及正常WI-38细胞的细胞毒活性（以多柔比星为参照）；以1 μg/mL LPS刺激的A549细胞为炎症模型，RT-qPCR（β-actin为内参，2^?ΔΔCt法）检测IL-6与TNF-α表达；纸片扩散法测对金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus* ATCC 6538）、大肠埃希菌（*Escherichia coli* ATCC 8739）及白色念珠菌（*Candida albicans* ATCC 10221）的抗菌活性（氨苄西林与克霉唑为阳性对照）。数据以均值±标准差表示，采用IBM SPSS 27.0分析。

## 三、研究结果

**壳聚糖与Ashwa-Chit NPs的表征**：Chit NPs的ζ电位为+42.2 ± 4.8 mV；载入提取物后降至+31.5 ± 4.8 mV，提示植物化学成分通过吸附和/或包封与壳聚糖基质结合并部分遮蔽表面氨基，但仍高于+30 mV，表明静电稳定充分、聚集倾向低。TEM显示Chit NPs主要呈球形，粒径26.67–52.11 nm，平均37.53 ± 9.37 nm；Ashwa-Chit NPs保持球形，粒径24.98–40.72 nm，平均34.15 ± 6.53 nm，均处于纳米尺度（<100 nm），其略小的平均粒径可能与提取物成分同壳聚糖聚合物基质在成粒过程中的相互作用影响颗粒致密化与结构组织有关。

**FTIR分析**：壳聚糖粉末呈3400–3500 cm^?1宽O–H/N–H伸缩振动、约2900 cm^?1 C–H伸缩振动、近1600 cm^?1酰胺相关谱带及1200 cm^?1以下多糖骨架振动；Chit NPs于3420 cm^?1呈宽吸收带，1154.95、1087.50及1018.21 cm^?1归属多糖骨架C–O–C与C–O伸缩振动。Ashwa-E于3415.83、2355.17及1653.09 cm^?1出现特征带（2355.17 cm^?1弱信号归因于大气CO₂吸收，不视为特征植物化学成分带）。Ashwa-Chit NPs于3411.00 cm^?1（O–H/N–H伸缩）、2920–2934 cm^?1（脂肪族C–H伸缩）、1635.29与1540.24 cm^?1（分别为酰胺I C=O伸缩与酰胺II N–H弯曲）及1154.95–1018.21 cm^?1（壳聚糖多糖骨架）出现吸收带。羟基/氨基宽带由3415.83移至3411.00 cm^?1，羰基相关带由1653.09移至1635.29 cm^?1，提示提取物成分与壳聚糖官能团间经氢键及其他非共价作用发生分子间相互作用；提取物与壳聚糖的特征带在纳米粒谱图中均可检出，且未出现提示新共价键形成的额外吸收带，表明载入主要经物理包埋与非共价相互作用实现。

**体外释放**：pH 4.5条件下，Ashwa-Chit NPs的累积释放随时间递增，实验开始为10.2%，8 h达69.9%，16 h达74.9%。作者指出因仅在单一pH值下进行实验，不能确立pH依赖性释放行为；前8 h释放增长较明显而后趋缓，可能反映纳米粒基质中成分可及性与扩散性的差异，但相关机制未经直接研究，无法确证具体释放机制。

**植物化学成分筛查（GC–MS）**：Ashwa-E中共鉴定44种化学成分，主要成分为1-[3-(2,6,6-三甲基环己-2-烯基)-4,5-二氢-3H-吡唑-4-基]-乙酮（RT 22.67 min；19.30%）、9-十八碳炔酸甲酯（RT 30.46 min；13.43%）、油酸乙酯（RT 30.59 min；12.72%）、十六烷酸乙酯（RT 26.76 min；5.37%）、3α,4α,9β,11-二环氧穆罗烷-10-醇（RT 26.51 min；4.37%）及十八烷酸乙酯（RT 31.05 min；3.69%）。其中主成分曾在*Vitex negundo*精油中被报道并与抗炎、抗菌活性相关，但文献检索显示其不常作为睡茄根提取物主要成分被报道；油酸乙酯亦罕见于睡茄根GC–MS谱。所鉴定成分中有15种具有文献记载的生物活性，这些化合物被报道具抗氧化、抗炎、抗菌及抗增殖特性，可能参与本研究所观察到的生物活性；作者因此认为所观察活性至少部分与多成分协同作用相关，而非依赖单一主导化合物。

**抗氧化活性（DPPH）**：各制剂均呈浓度依赖性清除活性，Chit NPs清除能力有限。IC₅₀依次为：抗坏血酸4.12 ± 0.02 μg/mL，Ashwa-Aqua 42.45 ± 0.22 μg/mL，Ashwa-Chit NPs 75.72 ± 0.75 μg/mL，Chit NPs 947.83 ± 3.40 μg/mL。Ashwa-Aqua抗氧化活性最强，可能因植物化学成分在反应介质中即时可及、可直接与DPPH自由基作用；Ashwa-Chit NPs的IC₅₀较高，可能因活性成分被包封于壳聚糖基质中而在测定期间暂时限制其可及性，持续释放特性可延迟自由基清除响应；尽管如此，纳米粒仍保留可观的清除活性，表明纳米粒制备未损害被包封成分的生物功能性。

**细胞毒活性**：各制剂均呈浓度依赖性抑制细胞活力，依El Sadda等（2023）分类（IC₅₀ 1–10、11–20、21–50、51–100及>100 μg/mL分别对应极强、强、中等、弱及无细胞毒性）。Ashwa-Aqua对HeLa细胞细胞毒活性最强（IC₅₀ = 18.11 ± 1.4 μg/mL），其次为MCF-7（28.63 ± 1.9 μg/mL）、HCT-116（35.10 ± 2.1 μg/mL）及A549（45.77 ± 2.6 μg/mL），即对HeLa为强活性、对其余癌细胞为中等活性。Ashwa-Chit NPs呈中等至弱活性，对HeLa、A549、HCT-116及MCF-7的IC₅₀分别为49.67 ± 2.7、47.59 ± 2.7、72.69 ± 3.8及60.83 ± 3.4 μg/mL；空白Chit NPs细胞毒性弱或可忽略（多数细胞系>85 μg/mL，对HCT-116>100 μg/mL）。Ashwa-Aqua活性较高可能因活性成分直接可及；纳米包封未增强细胞毒性，或与控释延迟成分可及性有关；两者对A549细胞活性相近，提示纳米包封未显著改变提取物对该细胞系的固有抗癌活性。正常WI-38成纤维细胞中，Ashwa-Aqua呈弱细胞毒性（IC₅₀ = 65.08 ± 3.7 μg/mL），Ashwa-Chit NPs毒性较高（IC₅₀ = 26.03 ± 1.7 μg/mL），Chit NPs基本无毒性（IC₅₀ >100 μg/mL）；Ashwa-Aqua对HeLa细胞的选择性指数约为3.59，提示对癌细胞 preferential 毒性；Ashwa-Chit NPs选择性降低，可能与阳离子壳聚糖纳米粒对正常与癌细胞均促摄取的非特异性细胞相互作用及持续释放限制活性成分即时可及有关。多柔比星在各细胞系IC₅₀为4.17–6.72 μg/mL，验证了试验有效性。不同细胞系敏感性差异可能与细胞摄取、胞内加工及对植物化学成分诱导细胞毒性的内在易感性不同有关。

**抗炎活性**：以各制剂对A549细胞的IC₅₀（Chit NPs 91.10、Ashwa-Chit NPs 47.59、Ashwa-Aqua 45.77 μg/mL）处理LPS刺激的A549细胞。各制剂均下调IL-6与TNF-α表达；其中Ashwa-Chit NPs抑制作用最强，使IL-6与TNF-α表达分别降至0.2808与0.3417倍；Chit NPs分别降至0.6429与0.7403倍；Ashwa-Aqua分别降至0.6312与0.7403倍。作者指出Ashwa-Chit NPs抗炎活性优于Ashwa-Aqua，提示细胞因子抑制并非仅取决于游离成分的即时可及性，而可能与纳米载体改善细胞相互作用、持续释放行为及壳聚糖与睡茄活性成分间潜在协同效应有关；此外壳聚糖本身的内在生物学特性亦可能部分贡献该活性。虽然本GC–MS分析未检出睡茄内酯，提取物中已鉴定成分可能共同参与所观察的抗炎效应，IL-6与TNF-α表达下降可能与NF-κB介导炎症信号调控相关。

**抗菌活性**：Ashwa-Aqua活性最强，对*E. coli*、*S. aureus*及*C. albicans*的活性指数分别为57.1%、75.8%及76.4%；Ashwa-Chit NPs呈中等活性，分别为41.4%、61.7%及52.1%。Chit NPs与DMSO对照在本实验条件下未检出抗菌活性。Ashwa-Aqua对*C. albicans*活性指数最高（76.4%），Ashwa-Chit NPs对*E. coli*最低（41.4%）；两种制剂对*S. aureus*的敏感性均高于*E. coli*，可能与革兰阳性菌与阴性菌结构差异有关——革兰阴性菌外膜脂多糖构成额外通透屏障，而革兰阳性菌富含肽聚糖的细胞壁通常更易被此类活性物质接近。纳米包封未增强抗菌效能，活性低于Ashwa-Aqua，可能与控释特性限制活性成分在孵育期间的即时扩散与可及性有关；纳米制剂的抗菌活性主要归因于被包封的睡茄提取物而非壳聚糖载体本身。

**抗氧化、细胞毒与抗炎活性间的相关性**：Ashwa-Aqua抗氧化活性最强、对所测癌细胞系细胞毒作用最高，可能与酚类及黄酮类等抗氧化植物化学成分清除活性氧（ROS）并促进恶性细胞凋亡有关；Ashwa-Chit NPs对A549细胞IL-6与TNF-α下调最显著，同时对正常WI-38成纤维细胞细胞毒性相对较低，提示纳米包封通过控释、增强细胞相互作用及改善生物相容性优化了递送特性。作者据此认为，不同递送系统可分别优化睡茄的不同生物学特性：水提物抗氧化与抗癌潜力更佳，而壳聚糖纳米制剂呈现更安全、更有效的抗炎特征。

## 四、讨论与结论

讨论部分将本研究结果与既往文献相互印证：睡茄水提物可经抑制TNF-α、IL-6及IL-8表达减轻LPS诱导的A549细胞炎症反应，并在LPS攻击小鼠体内减少炎性细胞因子产生及肺部中性粒细胞浸润；负载Ashwagandha的纳米囊经调节MAPK与Nrf2等炎症信号通路表现出优于游离提取物的生物活性；睡茄来源代谢物可调控TNF-α、IL-6、NF-κB、MAPK及JAK/STAT等主要炎症介质与信号通路；壳聚糖相关植物源制剂亦可抑制IL-6与TNF-α等炎症介质表达。作者强调，本研究中的差异不能完全归因于纳米包封，且受多项局限：未以经验证的分析方法定量包封率与载药量；未测定动态光散射（DLS）流体动力学直径与多分散指数（PDI），TEM数值仅代表干态表观粒径；释放研究仅在pH 4.5下进行，未设比较pH条件或拟合动力学模型，270 nm紫外–可见吸收未验证特异性；生物试验采用制剂标示浓度而非提取物归一化剂量。因此，未来研究需纳入经验证的包封率/载药量测定、DLS/PDI分析、多pH释放试验、动力学建模及基于标志物的生物处理归一化。

结论部分译文：本研究证明成功制备了负载睡茄根提取物的壳聚糖纳米粒，其具有纳米尺度、球形形态、良好胶体稳定性及持续释放特征，支持其作为植物化学成分递送系统的潜力。GC–MS分析揭示包含44种植物化学成分的化学多样性谱，其中若干成分既往被报道与抗氧化、抗炎、抗菌及抗癌活性相关。生物学评价显示各制剂活性模式各异：Ashwa-Aqua抗氧化、抗菌及抗增殖活性最强，尤其对*Candida albicans*及HeLa细胞；相反，Ashwa-Chit NPs抗炎活性更优，对LPS刺激的A549细胞中IL-6与TNF-α表达下调最显著。上述结果表明纳米包封并未一致增强全部生物活性，而是在保留被包封植物化学成分生物功能性的同时选择性改善抗炎性能。总体而言，结果凸显睡茄作为多功能生物活性化合物来源的潜力，并表明壳聚糖基纳米包封是通过控释调控植物化学成分生物活性的有前景策略；所观察效应可能归因于多种植物化学成分的协同作用而非单一主导化合物。在潜在药学或生物医学应用之前，尚需进一步研究以识别主要生物活性成分、阐明其分子作用机制、优化处方，并在适宜的体内模型中评价有效性、安全性、药代动力学及生物利用度。