基于适配体识别与酶促级联放大的磁调控上转换荧光平台用于谷物中黄曲霉毒素B1的快速筛查

《Food Chemistry: X》：A magnetically assisted upconversion fluorescence platform integrating magnetic separation and enzymatic amplification for rapid screening of aflatoxin B1 in grain samples

　　

研究人员开发了一种磁调控上转换纳米颗粒（UCNP）适配体传感器用于黄曲霉毒素B₁（AFB1）分析。AFB1诱导的辣根过氧化物酶（HRP）释放实现了氧化型3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（oxTMB）介导的荧光猝灭。磁调控促进了探针分离与信号产生。该分析方法在谷物样品中表现出良好的选择性和检测性能。

黄曲霉毒素B₁（AFB1）是曲霉属（Aspergillus）主要产生的有毒次级代谢产物，广泛污染谷物及其制品，具有强肝毒性、致突变性和致癌性，长期暴露带来严重健康风险，因此建立可靠的监测策略是食品安全控制的重要需求。传统检测方法如高效液相色谱（HPLC）、液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）准确性高但依赖昂贵仪器、复杂前处理和专业人员操作；免疫分析虽操作相对简便，却受抗体稳定性、批次差异和基质干扰限制。磁性纳米材料因磁响应性、快速分离能力和灵活的表面修饰而受到关注，超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）尤其被广泛研究；将金表面与磁性组分结合可提供化学多样性界面用于生物分子固定和探针构建。适配体因高特异性、化学稳定性和易修饰而被用作识别元件，上转换纳米颗粒（UCNPs）因近红外激发、低自发荧光背景和优异光稳定性适合复杂食品基质分析；HRP催化氧化TMB生成具有强可见吸收的oxTMB，其吸收与UCNP发射光谱重叠，可通过内滤效应（IFE）调控荧光。然而，将识别、酶促放大和光学调控集成于简化传感架构中的研究仍有限。为此，研究人员构建了集成聚乙烯亚胺修饰磁性金纳米复合材料（PEI-MGNPs）、HRP–TMB酶促级联和UCNP光学读出的磁控上转换荧光适配体传感器，将磁操控、适配体识别、酶促放大和上转换荧光集成于单一体系，检测在15 min内完成，检出限（LOD）为5 ng mL^?1，较既往需40 min、LOD为0.5 ng mL^?1的荧光适配体传感器显著缩短了检测时间，为谷物样品中真菌毒素筛查提供了快速、选择性好的实用途径。

研究人员采用的关键技术方法包括：高温分解法合成Gd掺杂NaYF₄:Yb/Er上转换纳米颗粒，并经酸处理与阿仑膦酸配体交换获得水分散性UCNPs；以柠檬酸盐还原HAuCl₄制备金纳米颗粒，通过静电吸附组装于PEI修饰的Fe₃O₄纳米颗粒上构建PEI-MGNPs，再经Au–S键固定巯基化AFB1适配体、牛血清白蛋白（BSA）封闭并以生物素–链霉亲和素作用偶联SA-HRP形成探针；利用磁分离结合TMB显色与980 nm激发下540 nm上转换荧光读数实现检测；采用透射电镜（TEM）、高分辨TEM、元素映射、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、X射线衍射（XRD）、紫外–可见吸收光谱、Zeta电位和荧光寿命等手段进行表征；实际样品为采自中国江苏南京的一份大米和一份玉米样品，经70%甲醇–水提取后进行加标回收实验，并以HPLC（Agilent 1260系统，C18柱，荧光检测器）作为参比方法。

研究结果方面，3.1 上转换纳米颗粒与PEI-MGNPs复合物的结构表征：TEM显示所合成含Gd的NaYF₄:Yb/Er UCNPs分散良好、呈均匀椭球形，平均粒径约35 nm，HRTEM显示清晰晶格条纹，元素映射显示Na、Er、Y、Yb和Gd分布；XRD衍射峰与标准六方相β-NaYF₄（JCPDS No. 28–1192）一致；FT-IR表明油酸配体特征带显著减弱并出现阿仑膦酸新吸收带，证实配体交换成功；PEI-MGNPs经TEM、FT-IR、XRD和紫外–可见光谱验证，XRD确认面心立方Au相与反尖晶石Fe₃O₄相共存，紫外–可见光谱在约540 nm显示Au表面等离子体共振带。3.2 磁控上转换传感平台检测AFB1的原理与验证：探针经适配体Au–S键固定、BSA封闭和SA-HRP偶联组装；AFB1识别诱导适配体构象变化，促使适配体–SA-HRP复合物在磁分离后进入上清液，释放的HRP在H₂O₂存在下催化TMB氧化生成oxTMB，其500–650 nm宽吸收带与UCNP约540 nm发射峰显著重叠，通过IFE衰减荧光；高浓度oxTMB（0.2 mM）存在时540 nm荧光强度显著下降而峰位不变；Zeta电位显示UCNPs-ADA、Fe₃O₄和AuNP为负电位而oxTMB与Fe₃O₄@Au为正电位；荧光寿命曲线经双指数模型拟合，加入TMB或oxTMB后平均荧光寿命无明显变化，表明荧光衰减并非显著激发态猝灭，而由IFE主导。3.3 检测条件优化：荧光强度随PEI-MGNPs浓度增加而下降并在约1 mg mL^?1趋于稳定，故选定1 mg mL^?1；pH在6.5–8.1范围内荧光响应先升后降，pH 7.3时最大，归因于HRP的pH依赖性催化活性，故选定pH 7.3。3.4 传感平台的分析性能与选择性：荧光强度随AFB1浓度（10–10⁶ ng mL^?1）增加而逐渐下降，在10–10⁴ ng mL^?1范围内线性更稳定，校准方程为Y = ?110,770X + 4550（R² = 0.9933），LOD为5 ng mL^?1；与已报道方法比较，部分电化学和表面增强拉曼散射（SERS）策略LOD更低但需复杂电极制备、昂贵仪器或专业操作，而该平台集成磁分离、适配体识别、酶促放大和UCNP荧光检测于单一流程，15 min内无需离心即可完成分析，同时存在LOD相对较高、磁性探针和UCNP信号组分制备涉及多步修饰组装而增加传感器构建复杂性的局限；选择性实验中OTA、DON和AFG1（各0.015 mg mL^?1）仅产生可忽略的荧光变化，仅AFB1引起显著响应，归因于适配体的特异性识别以及磁分离和BSA封闭降低非特异性干扰。3.5 性能增强机制的讨论：分析性能提升源于磁分离、适配体介导识别、HRP催化信号产生与IFE荧光调控的协同整合，PEI-MGNPs实现快速磁操控并促进传感组分与复杂食品基质分离从而降低背景干扰，UCNPs提供近红外激发、低自发荧光背景和高光稳定性，荧光寿命变化较小支持IFE为主导衰减机制。3.6 实际样品回收实验：大米和玉米加标样品中该平台回收率为80.2%–99.4%，CV为3.14%–4.75%；HPLC回收率为98.7%–105.5%，CV为2.40%–3.90%（HPLC校准方程Y = 185,432X + 1342.7，R² = 0.9986）；单因素方差分析（One-way ANOVA）显示组间差异在p < 0.05时具有统计学显著性，部分浓度下回收率略低可能与提取过程基质效应及检测机制差异有关，但结果仍在可接受范围内，与HPLC结果可比，支持该平台用于谷物类食品中AFB1快速筛查。

讨论部分指出，该生物传感器分析性能的提升归因于磁分离、适配体介导靶标识别、HRP催化信号产生和IFE荧光调控的协同整合；PEI-MGNPs实现快速磁操控并促进传感组分与复杂食品基质分离，降低背景干扰并简化检测流程；AFB1识别后适配体构象变化促使适配体–SA-HRP复合物从磁性载体脱落，使HRP相关信号产生过程在上清液中进行；HRP介导的TMB氧化生成oxTMB，其吸收与UCNP约540 nm发射的光谱重叠为IFE荧光衰减提供光谱学基础，酶催化促进oxTMB生成而IFE将吸收响应转换为可测的UCNP荧光衰减；加入TMB和oxTMB后UCNP荧光寿命变化较小，支持IFE而非显著激发态猝灭是主要荧光衰减机制；UCNPs的近红外激发、低自发荧光背景和高光稳定性支持复杂基质中的荧光检测，加标大米和玉米样品的满意回收率及与HPLC可比的 analytical结果进一步证明该集成策略用于谷物样品AFB1快速筛查的潜力。研究结论译为：本研究开发了一种集成磁分离–酶促放大–上转换荧光的策略，用于稻米中AFB1的快速筛查。该平台在简化的传感架构中集成了磁操控、适配体介导识别、HRP催化放大和基于IFE的荧光调控。PEI-MGNPs作为多功能载体用于探针组装和磁分离，UCNPs提供低背景荧光报告。通过这些功能模块的协同作用，AFB1识别事件经酶催化和光谱调控转化为放大的光学响应。所提出的方法表现出宽的分析响应范围，并实现了操作简化的快速分析。此外，在大米和玉米样品中获得了满意的性能，证明其适用于谷物食品分析。尽管灵敏度和探针制备仍需进一步优化，该集成策略为复杂谷物基质中AFB1的快速筛查提供了一种实用方法。