《PLOS Genetics》：Nicotinic receptor in dopamine neurons mediates learned odor choice
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烟碱型乙酰胆碱信号传导可调节哺乳动物中脑回路中的多巴胺能输出，并由此影响决策过程。在果蝇（Drosophila）中，前脑前内侧（protocerebral anterior medial，PAM）簇中的多巴胺神经元（dopamine neurons，DANs）
烟碱型乙酰胆碱信号传导可调节哺乳动物中脑回路中的多巴胺能输出，并由此影响决策过程。在果蝇（Drosophila）中，前脑前内侧（protocerebral anterior medial，PAM）簇中的多巴胺神经元（dopamine neurons，DANs）传递糖类奖赏信号，并在联想学习后促进对奖赏气味的趋近行为。尽管烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）已被证实参与调节PAM DAN的兴奋性和递质释放，但这种调节如何支持学习和记忆过程中的特定认知操作仍不清楚。本研究测试了nAChRs在PAM DANs中对于气味-糖类联想学习与记忆的作用。在所检测的九个nAChR基因中，PAM神经元中烟碱型乙酰胆碱受体α1亚基（Dα1）的缺失损害了食欲性记忆。与该需求一致，Dα1在转录本和蛋白水平均在这些DANs中被检测到，且在PAM轴突末梢和推定树突区域观察到Dα1斑点。重要的是，活体成像显示，PAM DANs中的Dα1敲低减弱了气味诱发的突触Ca2+信号，而糖类诱发的Ca2+反应基本保留。在行为学层面，PAM DANs中的Dα1敲低降低了双气味强制选择辨别任务中的表现，而在单气味追踪条件或先天气味选择中未检测到表现缺陷。综上，这些结果确定了PAM DANs中一种支持气味诱发突触活动的烟碱型机制，并在存在竞争性气味线索时促进习得性气味选择表现。
论文解读：果蝇PAM多巴胺神经元中Dα1烟碱型受体对习得性气味选择行为的调控机制
一、研究背景与科学问题
乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）和多巴胺（dopamine，DA）是构成认知功能重要轴线的关键神经递质，二者相互作用形成ACh-DA轴，将胆碱能驱动与多巴胺能信号在细胞区室和回路节点间联系起来。在哺乳动物中脑回路中，烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）通过突触前和胞体树突机制调节多巴胺能输出，进而影响决策过程。烟碱控制的失调与运动障碍和神经精神疾病（如尼古丁成瘾和精神分裂症）的病理生理相关，凸显了其在多巴胺神经元（DANs）正常功能中的关键作用。
果蝇是研究联想学习的理想模型。果蝇可将气味与糖类关联学习，记忆形成于蘑菇体（mushroom body，MB），其中约2000个内在的胆碱能Kenyon细胞（KCs）编码气味信息。前脑前内侧（PAM）簇中的部分DANs向MB传递糖类奖赏信号。约15个解剖学定义的PAM亚型覆盖MB叶，各亚型与靶区室内的KCs相互作用并调节KC至MB输出神经元（MBONs）的突触，而MBONs提供效价编码输出。尽管单细胞转录组和遗传数据表明PAM神经元表达多种nAChR亚基转录本，且超微结构重建显示KCs和MBONs与PAM末梢和树突间存在大量胆碱能突触，但烟碱调节在奖赏相关DANs中的明确认知功能仍不清楚。因此，研究人员系统探究了PAM DANs中nAChRs对食欲性学习的具体贡献。
二、研究内容与主要结论
本研究通过系统遗传筛选、基因表达分析、活体钙成像和行为学实验，明确了PAM DANs中Dα1亚基在气味-糖类联想学习和记忆中的特定作用。研究发现，Dα1缺失选择性地损害食欲性记忆，减弱气味诱发的突触Ca2+信号，且仅在需要竞争性气味选择的条件下损害习得性行为表现，而糖类诱发的反应和基本感觉功能不受影响。这一发现为理解ACh-DA轴在基于价值的决策中的细胞机制提供了果蝇模型。
三、关键技术与方法
研究人员综合运用了多种关键技术：通过转基因RNAi和CRISPR/Cas9介导的PAM神经元特异性基因敲除进行遗传筛选；利用转录报告基因和MiMiC蛋白陷阱技术以及细胞类型限制性smOLLAS标记策略检测Dα1表达；采用活体双色共聚焦成像结合活性区钙传感器GCaMP6s.brpS.mCherry测量PAM末梢的突触活动；行为学上使用T迷宫进行双气味强制选择、单气味无选择测试和气味泛化测试；并借助成年果蝇hemibrain连接组数据集分析PAM神经元的胆碱能输入。果蝇品系包括Canton-S野生型及多种BDSC品系。
四、研究结果
Dα1是PAM DANs中食欲性记忆所必需的
研究人员使用R58E02-GAL4驱动子在PAM神经元中逐一敲低九个nAChR亚基基因，初步筛选发现Dα1和Dα5敲低降低即时记忆。经完整遗传对照验证，Dα1敲低表型得到确认，而Dα5效应未被支持。成年特异性泛神经元表达相同RNAi构建体显著降低Dα1转录本水平，验证了RNAi试剂效力。采用独立遗传策略，通过R58E02-GAL4驱动Cas9与Dα1 sgRNA在PAM神经元中条件性敲除Dα1，同样损害食欲性记忆。Dα1敲低不影响基本感觉知觉（气味回避和糖类吸引），表明胆碱能输入主要参与记忆过程。
Dα1在PAM DANs中的表达
通过Dα1-2A-GAL4转录报告基因结合MB247-GAL80减少KC标记，观察到PAM体细胞区域和MB叶相关区域的GFP阳性标记。进一步采用R58E02-p65.AD与Dα1-2A-GAL4驱动的UAS-LexA.DBD交集策略，确认了具有双重活性的神经元位于PAM区域并支配奖赏相关MB区室。MiMiC蛋白陷阱技术显示Dα1蛋白信号与酪氨酸羟化酶（TH）标记的PAM末梢在MBγ叶尖端空间重叠。细胞类型限制性smOLLAS标记策略进一步在PAM神经元内检测到Dα1-smOLLAS斑点，分布于MB叶内外区域，包括推定树突/输入富集区域（蕈形体冠CRE和上内侧原脑SMP）及MB叶内轴突末梢区域。连接组分析为PAM神经元类别提供了预测和整理的胆碱能输入途径的解剖学支持。
Dα1介导多巴胺能末梢的气味反应
研究人员使用活性区钙传感器GCaMP6s.brpS.mCherry测量PAM末梢的突触活动。在对照果蝇中，气味刺激在β′1和α1末梢产生明显反应，而γ5末梢反应弱或不可检测；糖类刺激在α1和γ5末梢诱发反应，而β′1末梢无显著兴奋性反应。Dα1敲低显著减弱β′1和α1末梢的气味诱发反应（通过基因型×时期交互作用显示），其中β′1末梢对两种气味均显著，α1末梢仅对3-OCT显著。相反，对糖类有反应的区室（γ5和α1）中未检测到基因型依赖性的糖类诱发反应减弱。这表明Dα1特异性地支持气味诱发的PAM末梢活动，而糖类诱发反应基本保留。
Dα1调控习得性气味选择
在标准双气味选择任务中，Dα1敲低果蝇表现受损，且两种气味分配中均显示降低。然而，在单条件气味对空气的无选择测试中，Dα1敲低对4MCH和3-OCT均未显著降低表现，较低气味浓度下亦然。敲低果蝇在条件气味与新异气味之间选择时表现更差，而基于先天气味效价的选择不受影响。气味泛化测试中，Dα1敲低果蝇未显示泛化增加，反而比对照泛化更少，排除了过度泛化作为表型来源的可能性。这些结果表明Dα1依赖性信号在果蝇需要在竞争性气味替代物间选择时支持正常的习得性气味选择表现。
五、讨论与结论
研究确定了PAM DANs中Dα1依赖性烟碱信号在气味诱发PAM末梢活动和习得性气味选择表现中的作用，特别是在存在竞争性气味线索时。糖类诱发钙反应的保留表明经典食欲性强化通路基本功能完整。由于PAM定向操作未进行时间限制，发育贡献无法排除，但成年PAM末梢气味诱发反应的选择性减弱及糖类反应和基本感觉行为的保留支持Dα1在成熟PAM回路功能中的特定需求。
在回路层面，气味选择性Dα1需求与传递气味相关信息的胆碱能通路一致。由于PN对PAM的直接输入有限，气味相关胆碱能信号可能主要来源于PN下游。MB提供了直接底物：PN向MB萼中的胆碱能KCs传递强烈气味驱动，超微结构数据显示KCs与DANs在MB叶间存在广泛相互连接，单个PAM DAN接收数百个KC至DAN突触。Dα1斑点位于PAM轴突末梢区域，支持PAM轴突末梢作为胆碱能调节的潜在位点。
MBON引导的间接通路也可能塑造气味选择。PAM-β′2a群体参与冲突感觉线索整合、编码惩罚缺失和相对“优于”价值信号。其突触后伙伴MBON-γ5β′2a在消退和逆转学习中发生学习相关可塑性。胆碱能MBON-γ2α′1编码顺序体验的两种气味间的转换，向PAM-β′2a提供直接兴奋性输入。Dα1斑点位于推定树突区域可能参与此胆碱能反馈回路中的局部计算。这提示MB回路内的类似整合计算可能支持习得气味与参考气味间的相对价值编码，从而影响果蝇的选择决策。
本研究确定了PAM神经元中Dα1依赖性胆碱能信号影响习得性气味选择的可能途径，将Dα1依赖性气味诱发PAM末梢活动确立为该问题的细胞切入点。未来需测量多巴胺释放、条件化依赖的气味诱发PAM活动变化、竞争性气味同时呈现时的PAM反应以及气味-糖类整合，以确定该活动如何转化为多巴胺输出和选择相关行为。
