《European Journal of Cancer》：Computational image features of immune architecture reveal molecular patterns associated with outcome and risk of recurrence in microsatellite-stable or MSI-low colon cancers
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结直肠癌（colorectal cancer）为男女共患的第三常见恶性肿瘤，研究者估计2024年美国将有约153,000例新发与53,000例死亡。目前治疗手段包括手术切除、化学治疗、放射治疗与免疫治疗，但常面临显著治疗挑战，需个体化多学科处理。结直肠癌的预后
结直肠癌（colorectal cancer）为男女共患的第三常见恶性肿瘤，研究者估计2024年美国将有约153,000例新发与53,000例死亡。目前治疗手段包括手术切除、化学治疗、放射治疗与免疫治疗，但常面临显著治疗挑战，需个体化多学科处理。结直肠癌的预后评估主要依赖肿瘤分期与临床病理特征，包括肿瘤出芽、脉管侵犯与淋巴结转移。错配修复（mismatch repair, MMR）与分子检测可提供预后与治疗选择的补充信息。肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）——肿瘤细胞、免疫细胞与间质成分之间的相互作用——为新兴研究领域。定量肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes, TILs）已在多种肿瘤中证实可预测治疗反应与患者结局；然而，基于H&E染色样本的传统TIL密度评估在病理学家间存在变异，且单纯密度可能无法完整刻画免疫细胞与邻近组织成分之间的空间关系。近期研究尝试超越密度指标对TILs进行空间表征，在肺癌、乳腺癌、妇科肿瘤与头颈部肿瘤等多种瘤种中显示出良好前景；一项近期泛胃肠道肿瘤研究亦证实TILs与癌细胞核之间空间关系的预后价值，促使研究者对微卫星稳定（microsatellite stable, MSS）/MSI-low结肠癌中的空间免疫生物标志物及其在独立队列中的可推广性开展专门评价。在本研究中，研究者整合图像处理与人工智能（artificial intelligence, AI），开发了CoATIL（Colon Architecture of TILs）——一种基于H&E的计算病理标志物（computational pathology signature），用于量化结肠癌中TILs与邻近非TIL有核细胞的空间组织构型。研究者重点关注MSS与MSI-low（MSI-L）结肠癌，约占全部病例的85%；在该人群中，空间免疫构型可能提供独立于常规临床病理因素的预后信息。研究数据集纳入来自University Hospitals Cleveland Medical Center（UHCMC，n=192）、The Cancer Genome Atlas（TCGA，n=130）与广东省人民医院（Guangdong Provincial People's Hospital, GDPH，n=139）的461例患者。CoATIL旨在捕捉肿瘤微环境内的空间模式，并按疾病进展风险对患者分层，提供独立于常规临床病理因素的预后信息；研究者还将CoATIL与多种最新基础模型（foundation models）的性能进行比较，并探索性分析TCGA中CoATIL风险评分与基因组及转录组特征的关联，以提供分子层面的背景信息。
**研究背景与问题** 结直肠癌（colorectal cancer）为男女共患的第三常见恶性肿瘤，研究者估计2024年美国新发约153,000例、死亡约53,000例。其治疗手段包括手术切除、化学治疗、放射治疗与免疫治疗，但治疗挑战显著，需个体化多学科方案。预后评估主要依赖肿瘤分期与临床病理特征（肿瘤出芽、脉管侵犯、淋巴结转移），错配修复（mismatch repair, MMR）与分子检测提供补充信息。肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）为新兴研究方向，定量肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes, TILs）已被证实在多种肿瘤中可预测治疗反应与结局。然而，基于H&E染色样本的传统TIL密度评估在病理学家之间存在变异，且单纯密度可能无法完整刻画免疫细胞与邻近组织成分的空间关系。既往空间TIL表征研究在肺癌、乳腺癌、妇科肿瘤与头颈部肿瘤中显示前景，泛胃肠道肿瘤研究亦提示TILs与癌细胞核空间关系的预后价值，这促使研究者针对微卫星稳定（microsatellite stable, MSS）/MSI-low结肠癌开展空间免疫生物标志物研究并检验其在独立队列中的可推广性；该人群约占全部结肠癌的85%。
**研究设计与结论** 研究者整合图像处理与人工智能（artificial intelligence, AI）开发了CoATIL（Colon Architecture of TILs），一种基于H&E的计算病理标志物（computational pathology signature），用于量化结肠癌中TILs与邻近非TIL有核细胞的空间组织构型，并按疾病进展风险对患者分层，以提供独立于常规临床病理因素的预后信息；同时与多种基础模型（foundation models）比较性能，并在TCGA中探索风险评分与基因组、转录组特征的关联。CoATIL在UHCMC、TCGA与GDPH三个队列中均能对MSS/MSI-low结肠癌进行预后分层，且在调整临床病理因素后仍具预后价值，提示空间免疫构型可作为常规临床因素之外的补充性预后生物标志物。
**关键技术方法** 研究纳入UHCMC（D1，n=192；其中D1,t训练集n=140、D1,v留出验证集n=52）、TCGA（D2，n=130）与GDPH（D3，n=139）三个来源共461例II–IV期结肠腺癌（COAD）患者，每例分析一张全切片图像（whole-slide image, WSI）；用HistoQC质控并排除MSI-high、图像质量差及20×扫描病例。主要技术包括：基于ResNet架构的卷积神经网络进行肿瘤分割（以25张WSI对病理学家标注验证），提取2048×2048像素图块；以Stardist分割细胞核并结合Macenko颜色归一化与既往机器学习分类器将核判定为TIL/非TIL（在独立Lizard结直肠数据集291个图块上定量验证）；基于核质心距离（阈值55像素，约14 μm）层次聚类并构建凸包，提取簇数量、密度、交叠、全局图结构与簇质心紧致度等特征，按患者汇总为1,476维特征向量；以准备诱导不稳定性（preparation-induced instability, PII）过滤后保留232个特征，在D1,t中以LASSO-Cox筛选特征并构建风险评分，以训练集中位评分为阈值分层；比较UNI、Ctranspath、Gigapath、H-optimus、KAIKO、CONCH、PLIP、Hibou等基础模型经多示例学习（multiple-instance learning, MIL）聚合的预后模型；采用嵌套交叉验证、聚类距离敏感性分析、队列特异多变量Cox模型、SHAP值、时间依赖AUC、校准与决策曲线分析，并结合TCGA体细胞突变、差异表达、Reactome 2024/KEGG通路富集与单样本基因集富集分析（single-sample GSEA, ssGSEA）。
**研究结果**
*患者队列的临床病理特征* 通过汇总三队列461例患者的临床病理资料得出：平均年龄分别为68.04、63.91与63.98岁，男性占47.4%、53.1%与63.3%（P=0.016）；II期占D1的81.8%、D2的43.8%，D3全部为II期（P<0.001）；D1与D2以白人为主，D3全部为亚裔；D1与D3全部为MSS，D2中18.5%为MSI-low；中位随访分别为84.0、31.6与102.9个月，事件比例分别为32.3%、31.5%与25.9%（P=0.421）；术后治疗信息在D1与D3不完整、D2不可得。
*肿瘤分割与淋巴细胞检测性能* 通过将自动肿瘤掩膜与病理学家修正掩膜在25张WSI上比较得出：平均Dice为0.755、平均IoU为0.610；在独立Lizard数据集全部291个图块上，淋巴细胞检测与分类流程的精确率为0.630、召回率为0.962、F1为0.762，提示淋巴细胞敏感性高而精确率中等。
*CoATIL的预后能力* 通过LASSO-Cox在D1,t中构建最终由8个空间特征组成的CoATIL标志物得出：主要特征包括环绕非TIL簇的TIL簇百分比中位数、淋巴细胞成组因子及最小/最大图三角面积比；空间热图显示低风险图块中TIL成组更为显著；SHAP分析显示环绕非TIL簇的TIL簇为总体最大贡献特征，该特征与TIL成组因子数值越高预测风险越低。在D1,v中，模型对无进展生存（progression-free survival, PFS）具预后价值（HR 3.37，95% CI 1.23–9.21，P=0.018，C-index=0.67）；D2中HR 2.63（95% CI 1.36–5.08，P=0.004，C-index=0.62）；D3中HR 2.42（95% CI 1.23–4.75，log-rank P=0.01，C-index=0.65）。合并验证队列中，CoATIL在II期（n=238，事件60，HR 3.07，95% CI 1.83–5.15，P<0.001）与III期（n=63，事件21，HR 3.24，95% CI 1.28–8.19，P=0.013）内均可分层PFS；白种人（n=136，事件44，HR 2.60，95% CI 1.42–4.78，P=0.002）与亚裔（n=147，事件38，HR 2.35，95% CI 1.22–4.53，P=0.011）中亦见关联，黑种人（n=38，事件12）方向一致但未达统计学显著（HR 2.65，95% CI 0.83–8.44，P=0.100）。队列特异多变量Cox分析显示，连续CoATIL评分在D1,v调整年龄、性别、种族与分期后（HR 2.00，95% CI 1.33–3.00，P<0.001）、D2调整上述因素后（HR 2.04，95% CI 1.08–3.87，P=0.029）、D3调整年龄与性别后（HR 4.40，95% CI 2.04–9.50，P<0.001）仍与较差PFS相关；风险分层对训练来源阈值选择总体稳健。嵌套交叉验证（20次重复）留出C-index为0.682 ± 0.046，中位选择10个特征（范围0–11）；聚类距离在10–18 μm变化时评分排序基本保持（Spearman ρ 0.779–0.885），C-index为0.612–0.664（14 μm时为0.657）。
*CoATIL的比较预后性能与潜在临床效用* 通过在合并验证队列中比较各模型得出：联合临床-CoATIL模型C-index最高（0.69，95% CI 0.61–0.76），其次为CoATIL（0.66，95% CI 0.59–0.73），PLIP与临床模型均为0.61，TIL密度评分为0.59；连续CoATIL与联合模型评分每增加一个标准差均与较差PFS相关（HR 1.32，95% CI 1.13–1.55；HR 1.55，95% CI 1.28–1.88；均P<0.001），CTransPath、H-optimus、PLIP与CONCH亦呈名义显著关联。CoATIL的12个月AUC最高（0.721，95% CI 0.612–0.823），联合模型在24个月（0.695，95% CI 0.590–0.789）与36个月（0.747，95% CI 0.651–0.835）AUC最高；配对bootstrap比较支持联合模型较临床模型在C-index与36个月AUC上的改善，但未确立优于PLIP或单独CoATIL。校准分析显示36个月预测与观察事件概率在不同风险组存在差异，决策曲线提示CoATIL与联合模型相对全部干预或无干预可能具有净获益。
*与CoATIL相关的突变基因、预后基因标志与代谢通路* 通过在D2队列中分析具体细胞突变注释与H&E WSI的患者亚组（排除超突变样本）得出：AMER1（APC membrane recruitment protein 1）非 synonymous 突变与较低复发风险相关，FBXW7（肿瘤抑制基因）非 synonymous 突变与较高复发风险及较差预后相关。通过筛选与风险评分显著相关（Pearson相关，P<0.05）并在高、低风险组间差异表达（FDR<0.05，log2倍数变化>1）的基因，并结合Reactome 2024与KEGG富集分析得出：第一组基因（ADAM8、ATP6V0A4、IL1RN、MAGEA11、PTGS2、TREML2）富集于免疫系统相关通路，第二组基因（SLAMF9、SLC7A9、TNNI2、KLRG2、CPS1、OTUB2、WNT7A）与代谢通路及Wnt信号通路显著相关。通过ssGSEA对MSigDB中150个预定义基因集（hallmark、肿瘤相关与免疫相关基因标志）评分比较得出高低风险COAD患者的免疫微环境差异；并发现ADAM8与OTUB2等基因的表达对D2患者总生存（overall survival, OS）具显著预后意义。
**讨论与结论** 讨论指出，结肠癌遗传与表观遗传异质性显著，稳健且可推广的预后标志物识别仍具挑战；TIL密度等常用免疫指标在不同队列与临床亚组中预后价值不一致，促使研究者关注免疫丰度之外的空间组织构型。CoATIL在调整可获得的临床病理因素后仍与PFS相关，并在II、III期内显示预后关联，而单纯TIL密度未显示统计学显著关联，支持空间组织构型超越免疫丰度的潜在价值；与基础模型-多示例学习（FM-MIL）及临床模型比较提示CoATIL提供互补预后信息。研究结果延伸了研究者团队既往关于III期结肠癌TIL空间组织可分层风险的工作，将框架扩展至UHCMC、TCGA与GDPH队列并纳入II期风险分层，与"肿瘤为空间组织化生态系统"的观点一致。分子层面，高风险肿瘤富集FBXW7突变而AMER1突变与较低复发风险相关：FBXW7正常介导c-Myc、Notch等致癌蛋白降解，功能缺失稳定c-Myc信号，可经抑制T细胞招募趋化因子（如CCL5与CXCL9/10）及降低MHC I类表达导致免疫排斥；AMER1（FAM123B）促进APC介导的β-catenin降解，AMER1突变型MSS肿瘤Wnt通路活性可能低于经典APC突变肿瘤，从而可能保留更容许的免疫微环境，与低风险空间构型一致；高风险患者ADAM8、OTUB2、WNT7A等基因上调，与细胞外基质重塑、代谢重编程及Wnt/β-catenin信号通路等促进侵袭与免疫逃逸的过程一致，但这些关联的方向与生物学基础尚需进一步研究。与既往AI方法相比，Li等以深度学习识别关键组织区域并证实淋巴细胞存在的预后相关性，但未能捕捉空间结构模式；Tsai等的多组学多队列平台依赖难以解释的深度学习生存模型；本研究聚焦MSS/MSI-low疾病并采用显式空间描述符，便于结合组织学模式审视特征贡献，且跨三个人群验证。局限性包括：IV期代表性有限；样本量与事件数适中限制模型开发稳定性与亚组推断（尤其UHCMC验证与黑种人患者）；队列间分期构成与随访时长差异可能影响合并性能估计；特征不稳定性过滤仅限II期早期复发患者；术后治疗信息不完整限制调整；缺乏Immunoscore与基于循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）的微小残留病灶（minimal residual disease, MRD）数据而无法比较；Lizard独立评估显示淋巴细胞召回高但精确率中等，假阳性检测可能影响空间免疫特征计算；回顾性设计可能引入选择与混杂偏倚；基因组与转录组关联为探索性，不确立CoATIL风险模式的生物学机制；CoATIL仅作为预后标志物评估，未评估其预测治疗获益或反应的能力，需在随机辅助治疗试验队列中验证锁定标志物以评估治疗预测价值。研究结论为：CoATIL可从常规H&E切片中捕捉空间免疫构型的预后信息，并在UHCMC、TCGA与GDPH队列中获得验证；其显式空间描述符便于解释，与临床因素整合可改善部分预后性能指标；这些发现支持将CoATIL作为补充性预后生物标志物进一步评估，并需前瞻性研究界定其临床作用。
