基于DNA甲基化的食管腺癌免疫分型揭示不同亚型

《European Journal of Cancer》：DNA methylation-based immune profiling reveals distinct subtypes in esophageal adenocarcinoma

背景：食管腺癌（EAC）的发病率近年来显著上升，但患者预后仍然较差。尽管免疫治疗已被应用于EAC的治疗，但仅有部分患者获益，这提示需要更精准的患者分层策略。方法：本研究整合了两个大型多中心EAC队列（挪威食管癌联盟NORECa队列，n=232；食管癌临床与分子分层OCCAMS队列，n=285）的批量DNA甲基化数据，结合来自免疫学数据库与分析门户（ImmPort）的免疫基因信息，通过差异甲基化分析和无监督一致性聚类，识别了免疫相关的DNA甲基化特征。结果：研究人员鉴定出四个基于DNA甲基化的免疫亚型（IS1-IS4）。其中，最高甲基化亚型（IS3）表现出最低的CD8+T细胞相对比例和最高的调节性T细胞（Tregs）比例，呈现“冷”肿瘤免疫表型；而最低甲基化亚型（IS1）则显示出最高的B细胞和CD8+T细胞水平及最低的Tregs水平，更接近“热”肿瘤免疫表型。这些免疫亚型的特征在两个独立队列中得到验证。尽管各亚型间的5年总生存率无统计学显著差异，但IS3亚型患者呈现出更好的生存趋势。结论：本研究利用迄今最大且最具代表性的EAC队列之一，揭示了基于DNA甲基化的免疫分型可有效区分EAC患者的肿瘤免疫微环境（TME）组成，为EAC的表观遗传学免疫分型和潜在的免疫治疗反应预测提供了新的见解。

论文解读文章

研究背景与目的

食管癌是全球第七大癌症相关死亡原因，其中食管腺癌（EAC）是主要的组织学亚型之一，其发病率在过去几十年中显著上升，目前已成为西方国家的优势亚型。尽管多模式治疗方案改善了食管癌的预后，但5年总生存率仍徘徊在20%左右。对于局部晚期EAC，围手术期化疗或新辅助放化疗后行食管切除术是标准的根治性治疗方法。新辅助治疗相比单纯手术具有生存优势，但仅有部分肿瘤表现出完全的病理学缓解。免疫治疗，特别是免疫检查点抑制剂（ICIs），现已用于EAC的辅助和姑息治疗方案，近期也被推荐用于围手术期。然而，诸如PD-L1表达、微卫星不稳定性状态或肿瘤突变负荷等生物标志物并未在所有治疗场景中被用于患者筛选，这可能是仅部分患者表现出完全或部分应答的原因。

由于免疫治疗的临床反应受肿瘤-免疫相互作用的影响，分析肿瘤微环境（TME）可能揭示最有可能从这类治疗中受益的患者亚群。对肿瘤浸润免疫细胞的广泛分析比单独评估单一生物标志物（如PD-L1表达）更能预测ICIs的疗效。分子免疫分型已在多种癌症实体中显示出指导治疗决策和增强预后评估的价值。在EAC中，已有研究定义了“炎症型”、“浸润边缘型”和“荒漠型”免疫景观，反映了TME的异质性组成和免疫细胞浸润的空间分布。其他研究根据免疫相关基因的表达或免疫细胞比例对EAC患者进行分层，揭示了不同的免疫谱，这些谱具有潜在的不同免疫治疗敏感性，并提示了新的免疫治疗靶点。然而，这些分型方法均尚未进入临床应用。

研究表明，EAC中改变的DNA甲基化模式可以增强肿瘤分类、预测临床结局和治疗反应，并指导治疗策略。在其他癌症类型中，免疫相关基因启动子的DNA甲基化水平允许根据患者的临床结局和免疫景观对其进行分层。然而，EAC中的免疫相关DNA甲基化特征仍未得到探索。因此，本研究旨在整合批量DNA甲基化数据与免疫基因信息，识别EAC中基于DNA甲基化的免疫亚型，从而为EAC的TME表观遗传学图谱做出贡献。

主要技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   样本队列：纳入两个独立的多中心EAC队列——挪威食管癌联盟（NORECa）队列（n=232）和食管癌临床与分子分层（OCCAMS）队列（n=285）。
2. 2.
   DNA甲基化分析：使用Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip（NORECa队列使用v2.0版，覆盖超过935,000个CpG位点；OCCAMS队列使用v1.0版，覆盖超过850,000个CpG位点）捕获全基因组甲基化变化。
3. 3.
   免疫相关探针筛选：从免疫学数据库与分析门户（ImmPort）获取3118个免疫相关基因列表，筛选映射到这些基因启动子区域（TSS1500、TSS200、第一外显子和5'-UTR）的CpG探针。
4. 4.
   差异甲基化分析：使用'limma'R包鉴定肿瘤与正常样本之间的差异甲基化探针（DMPs），标准为错误发现率（FDR）校正p值<0.05且|Δβ|≥0.1。
5. 5.
   无监督聚类：使用ConsensusClusterPlus R包对免疫相关DMPs进行无监督层次一致性聚类，确定最佳亚型数量。
6. 6.
   免疫细胞浸润估计：使用MethylResolver工具，基于参考的DNA甲基化反卷积方法，估算10种免疫细胞类型（巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、NK细胞、B细胞、CD8⁺T细胞、记忆T细胞、树突状细胞和调节性T细胞Tregs）的相对丰度。
7. 7.
   生存分析：使用Kaplan-Meier方法和log-rank检验比较亚型间总生存期（OS），并使用Cox比例风险模型进行单变量和多变量分析。

研究结果

3.1 通过一致性聚类识别四种免疫亚型

在NORECa队列中，共鉴定出5799个免疫相关DMPs。无监督一致性聚类将患者分为四个免疫亚型：IS1（n=78）、IS2（n=62）、IS3（n=31）和IS4（n=61）。IS3的免疫相关DMPs甲基化水平最高，而IS1的最低，这与样本的整体CpG岛甲基化表型（CIMP）状态相一致。

3.2 EAC免疫亚型中的免疫细胞浸润景观

通过比较各亚型间的免疫细胞比例，研究发现单核细胞、B细胞、CD8⁺T细胞和Tregs存在显著差异。IS3（最高甲基化亚型）显示出最低的B细胞和CD8⁺T细胞相对比例，以及最高的单核细胞和Tregs比例。相反，IS1（最低甲基化亚型）显示出最高的B细胞和CD8⁺T细胞水平及最低的Tregs水平。使用所有DMPs（非仅限于免疫相关）进行的聚类未能重现这种清晰的免疫细胞差异，表明基于免疫特征的病人分层更好地反映了亚型间肿瘤免疫景观的差异。进一步的多变量分析和CIMP分层分析显示，免疫亚型与CD8⁺T细胞和Tregs的关联并非完全由CIMP驱动，但CIMP相关的甲基化模式仍可能有所贡献。

3.3 四个免疫亚群的临床病理学特征和预后价值

免疫亚型与年龄、肿瘤细胞百分比和新辅助治疗显著相关，但与性别或T分期无关。IS1具有最低的中位肿瘤细胞百分比和最高的接受新辅助治疗患者比例。在新辅助治疗和未治疗患者中分别进行的分析显示，免疫细胞景观在各亚型间高度一致，表明新辅助治疗状态对识别的免疫亚型影响有限。虽然IS3显示出最佳生存趋势（平均总生存期40.2个月，其他亚型为34.0-36.7个月），但五个亚型间的5年总生存期无统计学显著差异。多变量Cox回归证实免疫亚型与生存无显著关联，而T分期仍是最强的预后决定因素。

3.4 四个免疫亚型的验证

在OCCAMS队列中，同样鉴定出四个一致的免疫亚型（IS1-O至IS4-O）。与NORECa队列结果一致，最高甲基化亚型（IS3-O）再次显示出最低的CD8⁺T细胞和最高的Tregs相对比例。IS3-O也包含预后最好的患者（平均总生存期40.6个月），但5年总生存期差异不显著。使用两个队列重叠的免疫相关DMPs进行分析时，结果高度一致。为排除肿瘤细胞含量的影响，研究人员选取了NORECa中与OCCAMS肿瘤含量（≥70%）匹配的65例患者子集进行分析，同样鉴定出四个亚型，且最高甲基化亚型（IS3-Ns）再次显示出最低的CD8⁺T细胞和最高的Tregs比例，以及最佳生存趋势，验证了分型的稳健性。

讨论与结论总结

讨论部分总结：本研究表明，基于免疫相关基因启动子DNA甲基化模式的聚类可将EAC患者分为具有不同肿瘤浸润免疫细胞组成的亚型。IS3（高甲基化）的特征与“冷”肿瘤表型一致，表现为低细胞毒性活性，类似于之前描述的“荒漠型”免疫景观；而IS1（低甲基化）的特征更符合“热”肿瘤或“炎症型”免疫表型，具有强大的抗肿瘤免疫。值得注意的是，IS1中超过93%的患者接受了新辅助治疗，这已知可调节TME向更“炎症型”转变。基于此，可以假设IS3患者可能对免疫治疗更具耐药性，而IS1患者可能反应更好，但这需要在有详细免疫治疗数据的队列中验证。尽管“热”肿瘤通常预后更好，但本研究中IS3却显示出最佳生存趋势，这可能受到多种混杂因素的影响，包括缺乏完全新辅助治疗应答者以及术后接受进一步治疗的患者。肿瘤细胞含量本身似乎不影响免疫分型，因为在高肿瘤含量子集中结果得以复现。研究的局限性包括缺乏完全病理缓解患者、新辅助治疗反应的异质性、缺失辅助治疗信息，以及使用基于DNA甲基化的反卷积方法可能无法捕捉所有免疫细胞群体。此外，不能排除CIMP相关甲基化模式对分型的贡献。

研究结论翻译：本研究通过分析来自一个大型多中心EAC队列的批量DNA甲基化数据，基于免疫相关特征识别出四个不同的亚型，为EAC肿瘤微环境的表观遗传学图谱提供了新见解。这些免疫亚型在DNA甲基化水平上存在差异，并与特定的肿瘤浸润免疫细胞组成和临床病理学特征相关联。这些新颖的表观遗传学免疫亚型在一个独立的、来自OCCAMS联盟的多中心EAC队列中得到了验证。这项工作推进了EAC肿瘤微环境的表观遗传学分析，利用了迄今为止用于TME表征的最大且最具代表性的EAC队列之一。所识别的免疫亚型为EAC肿瘤微环境的表观遗传学景观提供了新见解，并揭示了其细胞组成上的显著差异。在大规模外部队列中的验证强调了该方法的稳健性，有助于克服EAC系列通常样本量有限的挑战。