《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》：Development and performance evaluation of an easy-to-use multiplex qPCR assay for the diagnosis of human visceral leishmaniasis
编辑推荐：
内脏利什曼病（VL）的准确及时诊断对有效疾病监测和控制至关重要。尽管体外诊断技术已取得显著进展，但在许多地区，稳健、高性能、可及且用户友好的诊断检测方法仍然有限。内脏利什曼病（VL）仍是一种被忽视的热带病，每年在80多个国家估计发生50,000–90,000例
内脏利什曼病（VL）的准确及时诊断对有效疾病监测和控制至关重要。尽管体外诊断技术已取得显著进展，但在许多地区，稳健、高性能、可及且用户友好的诊断检测方法仍然有限。内脏利什曼病（VL）仍是一种被忽视的热带病，每年在80多个国家估计发生50,000–90,000例新病例，尤以巴西、东非和印度为重。世界卫生组织（WHO）估计仅25–45%的病例被报告。根据WHO路线图《结束忽视，实现可持续发展目标：2021–2030年被忽视热带病路线图》，目标是使85%的流行国家实现消除作为公共卫生问题的验证，即原发性内脏利什曼病所致病死率低于1%。同一文件强调，当前VL诊断工具需大幅改进以实现2030年目标，并将早期诊断（快速诊断试验结合临床评估）和及时治疗确定为关键战略干预措施。由杜氏利什曼原虫（Leishmania (Leishmania) donovani）或婴儿利什曼原虫（L. infantum）感染所致的肝脾热性综合征患者，其确诊仍具挑战性。目前诊断主要依赖寄生虫学方法，需骨髓穿刺等侵入性操作，且敏感性有限。替代方案如酶联免疫吸附试验（ELISA）和快速诊断试验（RDT）常用于检测抗利什曼原虫抗体。这些试验，尤其是RDT，在具有VL临床疑似症状的免疫功能正常个体中已显示较高的合并诊断准确性。然而，血清学试验在免疫功能受损个体，尤其是合并HIV感染者中诊断性能显著降低，主要因敏感性较低。此外，血清学试验的敏感性存在地域差异，且因交叉反应和治愈后抗体持续存在，其特异性可能降低。分子诊断检测可克服这些局限。在外周血中检测利什曼原虫DNA或RNA已成为开发非侵入性、高敏感性VL诊断方法的有前景途径。已描述靶向不同基因组区域的多种分子检测方法，包括核糖体RNA基因、动基体DNA（kDNA）、小外显子衍生RNA、β-微管蛋白基因、糖蛋白63、核糖体内转录间隔区（ITS）、热休克蛋白70（HSP70）、剪接前导RNA和DNA聚合酶基因。然而在巴西，由于缺乏在巴西卫生监管局（ANVISA）注册的市售分子诊断试剂盒，基于PCR的诊断一直由隶属于巴西卫生部的参考实验室采用自建方法进行。分子诊断的一项重要进展是多重qPCR检测方法的开发，可在单次反应中同时检测多个分子靶标及内源性对照。本研究评估了一种用于诊断人类内脏利什曼病的多重qPCR检测方法的临床性能，该法设计为同时检测两个利什曼原虫分子靶标：用于检测利什曼原虫属（Leishmania spp.）的18S rDNA和用于特异性检测婴儿利什曼原虫（L. infantum）的kDNA，并包含内源性对照（GAPDH）。本研究支持了ANVISA批准首个用于VL诊断的分子诊断试剂盒——qPCR IBMP Biomol Leishmaniose?试剂盒（ANVISA注册号80780040026），该试剂盒由非营利巴西组织IBMP与Fiocruz/巴西卫生部合作开发。
研究背景：内脏利什曼病（VL）是一种被忽视的热带病，全球每年估计发生50,000–90,000例新病例，分布于80多个国家，但WHO估计仅25–45%的病例被报告。WHO 2021–2030年被忽视热带病路线图提出在85%的流行国家实现消除作为公共卫生问题的验证（原发VL病死率低于1%），并强调现有VL诊断工具需大幅改进，将早期诊断和及时治疗列为关键战略干预。目前VL确诊主要依赖需骨髓穿刺等侵入性操作且敏感性有限的寄生虫学方法；酶联免疫吸附试验（ELISA）和快速诊断试验（RDT）等血清学方法虽在免疫功能正常者中准确性较高，但在免疫受损者（尤其合并HIV感染者）中敏感性显著降低，且敏感性存在地域差异、特异性可因交叉反应和治愈后抗体持续存在而降低；巴西因缺乏在巴西卫生监管局（ANVISA）注册的市售分子诊断试剂盒，PCR诊断仅由卫生部参考实验室以自建方法开展。外周血利什曼原虫DNA检测为非侵入性高敏感途径，而多重qPCR可在单次反应中同时检测多个靶标及内源性对照，为此研究人员开发并评价了同时检测利什曼原虫属18S rDNA、婴儿利什曼原虫（L. infantum）kDNA及内源性对照GAPDH的多重qPCR检测方法，以支持巴西首个VL分子诊断试剂盒的监管审批。结论：该试剂盒在外周血样本中检测婴儿利什曼原虫DNA显示出高准确性（99.4%），两个分子靶标诊断性能一致，为巴西国产VL分子诊断试剂盒的获批提供了重要证据，但仍需在其它流行国家样本中验证并开展实验室间验证和成本效益研究。
主要关键技术方法（不超过250字）：研究人员采用回顾性诊断准确性研究设计，遵循STARD 2015指南并经Instituto René Rachou（IRR）/FIOCRUZ伦理委员会批准（CAAE: 67803317.4.0000.5091）。以参考株和培养虫株DNA进行多重qPCR标准化，优化引物与探针浓度，在7500实时PCR系统上进行扩增。分析性能评价包括以Probit回归模型估算95%置信限检测限（LoD95）、由三名操作者评估重复性、以三台热循环仪评估再现性，以及采用包含性和排他性分析评估分析特异性。样本来自IRR/FIOCRUZ临床研究与感染及寄生虫病公共卫生政策实验室（PCPP）生物样本库，采集于2010–2014年、储存于?20°C的外周血DNA（QIAamp DNA Mini Kit提取），并以kDNA PCR复检；共纳入175份样本（73例VL确诊病例与102例对照，含HIV合并感染者及非流行区健康献血者样本，后者来自巴西库里蒂巴Paraná血液与血液治疗中心Hemepar），采用复合参考标准（骨髓涂片寄生虫学确认、rK39快速试验阳性和/或kDNA PCR阳性）进行盲法检测，以2×2列联表和精确二项统计计算敏感性、特异性和准确性及95%置信区间（95% CI）。
研究结果：不同引物和探针浓度用于优化多重扩增，最终选定Linfatum-F/R 300 nM、Linfatum-P 100 nM、Leish-F/R 200 nM、Leish-P 200 nM、GAPDH-F/R/P 400 nM。经Probit回归模型插值检测率与分析物浓度，18S rDNA靶标的LoD95为0.58个寄生虫当量/反应（95% CI：0.36–1.34），kDNA靶标为0.16个寄生虫当量/反应（95% CI：0.11–0.30）。重复性分析显示18S rDNA靶标相对标准偏差（RSD%）低于5%、kDNA靶标低于9%，均在可接受限（<10%）内；再现性评估中两个靶标RSD值均≤5%。分析特异性评估显示18S rDNA与kDNA靶标在任一测试浓度下均未扩增其他寄生虫或锥虫DNA；包含性分析显示18S rDNA靶标扩增所有评估的利什曼原虫种（L. amazonensis、L. braziliensis、L. guyanensis和L. infantum），而kDNA靶标仅扩增L. infantum DNA。诊断准确性评价使用全血提取DNA（n=175，73例VL病例和102例对照），内源性对照GAPDH在所有样本中成功扩增，平均循环阈值（Ct）为24.2±0.47；两个分子靶标显示相同的诊断性能，仅观察到1例假阴性（来自无HIV合并感染的儿科患者，其kDNA PCR利什曼原虫属检测为阳性）；真阳性72例、假阴性1例、真阴性102例、假阳性0例，敏感性98.6%（92.6–99.9）、特异性100%（96.5–100）、准确性99.4%（96.9–99.9）。
讨论部分总结：本研究描述了首个同时检测利什曼原虫属18S rDNA与L. infantum特异性kDNA靶标并含内源性哺乳动物对照GAPDH的多重qPCR检测方法，可确保样本质量并确认DNA扩增成功。两个靶标既往曾被单独用于VL诊断评价；kDNA为利什曼原虫属和其他锥虫的线粒体基因组，由数十个 maxicircle 和数千个 minicircle（每细胞约10,000拷贝）组成的 concatenated 网络构成，minicircle含可进行亚属水平区分的保守区和可进行种间区分的可变区；18S rDNA为核小核糖体亚基（SSU）组成部分，在锥虫中高度保守，每基因组约160拷贝，因其多拷贝特性被广泛用于敏感分子检测并用于利什曼原虫种系统发育分析。本检测方法的LoD95与既往kDNA检测（Mota等报道双链qPCR LoD95为0.16个寄生虫/反应；Rampazzo等报道LoD为0.1个寄生虫/反应）及18S rDNA双链qPCR（0.01和0.2个寄生虫/反应）等报道相当，其他靶标报道的LoD从剪接前导RNA的0.002–0.005个寄生虫/反应到kDNA的1个寄生虫/μL血液不等，差异可能与基因拷贝数、验证所用虫种及双链或多重配置有关。分析特异性显示18S rDNA检测所有评估虫种而kDNA特异检测L. infantum，对其他寄生虫DNA无扩增，较既往靶向18S rDNA或kDNA且对克氏锥虫（T. cruzi）DNA等出现非特异扩增的检测具重要优势，这在恰加斯病仍流行且与VL地理重叠的巴西尤为重要，既往血清学和分子检测中两病交叉反应常见；尽管分析评价证明kDNA对L. infantum的特异性，仍需用不同嗜皮肤利什曼原虫种所致皮肤和黏膜利什曼病患者的样本进一步评价。该多重qPCR对疑似人类VL患者外周血中L. infantum DNA检测显示高诊断准确性（99.4%），外周血采样为微创方法，据报道在PCR检测中诊断敏感性与骨髓样本相当；因VL无公认单一金标准，本研究采用复合参考标准，将kDNA PCR纳入参考标准会引入纳入偏倚，但两种检测在引物探针序列、扩增化学和平台（常规PCR与实时PCR）上差异显著，且73例VL病例中71例骨髓寄生虫学检查亦为阳性，降低了该偏倚的潜在影响。迄今仅有一项评价双链qPCR诊断人类VL准确性的研究报告（Chicharro等，准确性97.8%），总体准确性相似，但本研究方法可种特异性检测L. infantum，而后者靶向利什曼原虫属；尽管在巴西样本中准确性高，仍需纳入其他流行国家VL患者样本进一步评价，并进行实验室间验证。本研究kDNA引物探针此前用于犬VL诊断，血液和脾样本敏感性91.7%、皮肤样本100%，各基质特异性均100%；试剂盒中两靶标临床性能相同，因其为广泛用于利什曼原虫检测的多拷贝基因组区域，二者联合可能提高VL病例检出机会；尽管L. infantum为美洲VL主要病原，但偶有L. braziliensis和L. amazonensis等嗜皮肤种致内脏化的报道，此时可能仅18S属特异性探针扩增而L. infantum特异性kDNA探针阴性，临床医生解读时应考虑此可能，可借助PCR-RFLP或基因测序确定感染虫种。该试剂盒的高诊断准确性、较常规PCR更短的周转时间、闭管形式降低交叉污染风险、可同时处理数十份样本及与多种实时PCR平台（Applied Biosystems 7500、7500 Fast和QuantStudio 5；Loccus Amplio96；Bio-Rad CFX96）的兼容性支持其临床适用性；但常规公共卫生实验室实施qPCR诊断仍存在障碍，巴西基层卫生单位实验室负责人类内脏利什曼病（HVL）诊断，开展rK39抗原免疫层析试验和无鞭毛体检测，分子诊断仍限于地区/国家参考中心，主要因需适当物理基础设施、昂贵设备和专业人员；COVID-19大流行后包括巴西在内的多国分子诊断基础设施显著扩展，巴西中央公共卫生实验室已具备必要设施和合格人员，可能促进分子诊断用于VL疑似病例确认；该试剂盒靶标组合还为未来评价TL和犬VL诊断提供机会。除为使用外周血样本的稳健简化qPCR检测提供诊断性能证据外，本研究是巴西全国产分子诊断检测用于VL监管审批的重要里程碑，所有组分均国内生产，但在巴西卫生部国家VL监测与控制规划内实施前仍需成本效益研究。
研究结论翻译：本研究描述了一种简便多重qPCR检测方法的开发与性能评价，该法用于诊断人类内脏利什曼病，并显示qPCR IBMP Biomol Leishmaniose?试剂盒在外周血样本中检测婴儿利什曼原虫DNA具有高准确性。
