一种高灵敏度高特异性外延探针 - 等位基因特异性 PCR 方法检测 BRAF V600E 突变

《Biology Methods and Protocols》：Establishment of a Method for Detecting BRAF V600E Mutation Using an Epitaxial Probe - Fluorescence Quantitative PCR with the classical four - primer ARMS - PCR Architecture

摘要

本研究提出了一种创新的外延探针-等位基因特异性PCR（EPAS-PCR）方法，用于高灵敏度和特异性地检测BRAF V600E突变。通过将一个与目标无关的延伸序列连接到内等位基因特异性引物的5′端，并将其与通用引物和TaqMan探针结合，该方法将传统的四引物扩增抵抗突变系统PCR（ARMS-PCR）转变为封闭管实时qPCR系统，从而省去了凝胶电泳步骤。其核心创新点在于将突变识别与信号生成过程分开：只有当内引物特异性地扩增突变模板时，下游的探针系统才会产生荧光。外引物F1负责预扩增，并能够竞争性地抑制野生型的非特异性扩增。使用缺乏3′→5′外切酶活性的Taq聚合酶对于保证方法的特异性至关重要。该检测方法的线性度良好（R2 ≥ 0.99），检测范围为1×10?至1×10?拷贝/μL。在质粒混合物中，该方法在10?拷贝/反应的浓度下可检测到0.137%的突变比例，在10?拷贝/反应的浓度下可检测到0.412%的突变比例；在基因组DNA标准品中，检测限为0.2%，优于传统的ARMS-PCR。与ARMS-PCR相比，EPAS-PCR避免了因省略外引物而导致的灵敏度下降和非特异性问题。直接比较显示，不使用F1的ARMS-PCR在大约第40个循环时会产生假阳性结果，而完整的EPAS-PCR在整个实验过程中均无信号产生。EPAS-PCR方法具有模块化设计、开发流程简单以及性能可靠等优点。除了检测BRAF V600E突变外，该方法还适用于其他核酸点突变的检测，代表了一种具有广泛应用前景的新策略。