单细胞基准分析揭示气液界面皮肤模型中表皮分层与附属器程序维持的解偶联

《Cell Transplantation》：Single-cell benchmarking separates epidermal stratification from appendage programme maintenance in an air-liquid interface skin model

　　

全层皮肤等效物（full-thickness skin equivalents, FTS）可重现表皮分层，但很少生成毛囊或腺体。定义与该局限性相关的细胞特征可为工程化附属器承载皮肤提供依据。本研究利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）对小鼠诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）衍生的早期上皮祖细胞（early epithelial progenitors, EEPs）及EEP来源的FTS进行剖析，并以发育中的小鼠皮肤作为参照。FTS建立了富含基底细胞的分层表皮，但伴随附属器启动细胞的显著减少（1.17%，而EEPs为8.69%）。发育映射显示，映射至毛囊轨迹的FTS细胞集中于早期位置，而EEPs则覆盖更晚且更广泛的对应区间。与匹配的发育期皮肤状态相比，FTS上皮表现出更强的损伤应答和反应性转录程序。这种上皮反应性与推断的真皮-上皮信号网络相吻合，该网络具有较弱的骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）和非经典WNT输入、无上皮Hedgehog通讯，并偏向成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF）及细胞外基质相互作用。综上，这些发现将FTS中有限的附属器形成归因于附属器启动减少、反应性毛囊间表皮状态以及偏离天然发育微环境的重塑真皮信号环境。

单细胞基准分析揭示气液界面皮肤模型中表皮分层与附属器程序维持的解偶联

研究背景与科学问题

皮肤替代物对于修复大面积烧伤或创伤造成的皮肤缺损至关重要。目前的临床手段包括半合成真皮支架、人工真皮替代物及自体细胞递送系统，它们能够实现创面覆盖或促进再上皮化。然而，传统重建皮肤缺乏附属器，恢复毛囊和腺体仍是创面覆盖与生物学完整皮肤重建之间的关键差距。全层皮肤等效物（full-thickness skin equivalents, FTS）是皮肤病学研究中广泛使用的平台，因其能够可靠地在真皮支架上重现分层表皮。尽管具备稳健的物理分层，但在这些平面结构中从头发生附属器形态发生仍不常见。与此同时，先进的三维（three-dimensional, 3D）干细胞培养系统已证明可以启动附属器程序并在体外生成含毛囊的皮肤。然而，如何将具有附属器能力的上皮转化为标准平面皮肤等效物工作流程中可靠的附属器形态发生，仍然是一个生物学瓶颈。工程化皮肤成熟过程中伴随这种附属器潜能丧失的发育变化仍未得到明确定义。

研究方法概述

本研究采用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术，对小鼠诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）来源的早期上皮祖细胞（early epithelial progenitors, EEPs）及其衍生的FTS进行转录组分析，并以Ge等人发表的发育中小鼠背侧皮肤数据集（GSE131498，包含E13.5、E16.5和P0阶段）作为毛囊和毛囊间表皮（interfollicular epidermis, IFE）的体内发育参照。此外，还使用了Dingwall等人的外泌腺发育图谱作为外泌腺参照。分析方法包括CCA锚定整合、基于嵌套多基因证据阶梯的附属器程序评估、时序最优运输、概率性发育映射、配对差异表达分析和基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA），以及CellChat介导的信号通讯分析。

研究结果

FTS形成富含基底细胞的分层表皮输出

通过对14,963个EEP和10,435个FTS上皮细胞进行联合可视化，鉴定出基底（Basal）、过渡态上皮（Transitional epithelium）和分化态上皮（Differentiating epithelium）三种共有比较状态。基底细胞占EEP的68.4%和FTS的83.0%。免疫荧光证实了两种系统中的上皮组织和从基底层到棘层的分层结构，但未观察到毛囊或基板。因此，FTS实现了富含基底细胞的分层表皮输出，但未形成附属器。

FTS中协调的早期附属器程序证据显著减少

研究应用相同的证据阶梯对所有EEP和FTS上皮细胞进行评估。附属器启动细胞需表达至少两个通用附属器基因且附属器评分处于其数据集的最高十分位。结果显示，EEP中有1,301个细胞（8.69%）被鉴定为附属器启动，包括125个附属器高表达细胞（0.84%）和1个具后期毛囊支持的细胞；而在FTS中，仅有122个细胞（1.17%）为附属器启动，3个细胞（0.03%）为附属器高表达，无一满足后期毛囊标准。附属器证据集中在基底状态，EEP基底细胞中附属器启动比例为10.3%，FTS仅为1.1%。时序最优运输显示，大多数附属器启动的EEP源对应于FTS基底目的地。这表明EEP中富集的附属器程序在FTS中被耗尽。

FTS偏好毛囊间表皮发育对应关系，后期毛囊对应关系有限

研究人员将EEP和FTS细胞投射至Ge发育参照的两个轨迹——毛囊（hair follicle, HF）路线和毛囊间表皮（interfollicular epidermis, IFE）路线。在附属器启动细胞中，EEP有596个（45.8%）满足HF支持门控，中位条件HF位置为0.795；FTS仅有50个（41.0%）满足条件，中位位置为0.675，且局限于早期HF位置。沿IFE路线，EEP有5,894个（39.4%）和FTS有4,873个（46.7%）满足支持标准，两者中位条件IFE位置均为0.322，接近天然Ge IFE轨迹的中位值（0.327）。FTS细胞集中于E16.5 IFE基底位置附近。这说明FTS发育范围变窄，偏向IFE对应关系。

FTS发育变窄伴随反应性和炎症反应重塑

研究人员将943个Ge IFE基底细胞与943个具有相似投射IFE伪时间的FTS基底细胞进行一对一匹配。差异表达分析和GSEA显示，FTS中内质网应激/蛋白质稳态和反应性损伤程序评分更高，富集了未折叠蛋白反应、整合应激反应、IL-17、NOD样受体和TNF响应程序；而匹配的Ge细胞富集了细胞周期、表皮发育、WNT和Hedgehog程序。压力相关基因如Krt6a在FTS中高度表达（97.2%对比1.6%）。对50个具HF路线支持的附属器启动FTS细胞进行同样匹配，也观察到类似的反应性重塑和应激响应程序富集。这定义了FTS的相关反应性上皮背景。

FTS真皮信号偏向FGF和细胞外基质相互作用

研究人员使用CellChat比较FTS中真皮与上皮之间的通讯与体内毛囊诱导期间的信号传导。FTS真皮细胞经无监督聚类形成四个簇，无一满足Ge真皮凝聚体/真皮乳头（dermal condensate/dermal papilla, DC/DP）对应标准。从间充质到上皮方向，Ge DC/DP前体细胞显示出BMP和非经典WNT通讯（中位总概率分别为0.190和0.0806），而FTS中相应概率仅为0.00391和0.00273。相反，FTS真皮输入偏向FGF、纤连蛋白和层粘连蛋白通讯，由真皮中Fgf7、Fgf10、Tgfb1和Fn1的广泛表达支撑。在反向方向上，Ge基板/早期HF上皮向DC/DP前体展示FGF20-FGFR1和SHH-PTCH1/PTCH2通讯，而FTS仅恢复微弱FGF通讯且无HH通讯。附属器启动的FTS细胞保留了部分BMP和FGF受体组分，但Edar、Lef1、Axin2和Etv4表达受限。

FTS与外泌腺替代发育状态的对应关系有限

研究人员使用Dingwall对照图谱作为独立的外泌腺路线参照。EEP中有1.37%的上皮细胞映射至早期外泌腺Epi3，5.68%映射至新生外泌腺Epi5/Epi8；FTS中分别仅有0.34%和3.11%映射至相应状态。KRT19在FTS上皮各层广泛分布，而AQP5染色稀疏且局灶，未见离散腺体结构。FTS保留了Krt8、Krt18和Krt19在过渡态或分化态上皮中的表达，但几乎无早期或新生外泌腺标志物的协调表达。

讨论与结论

传统FTS在气液界面培养下支持表皮分层和屏障分化，但其屏障功能不完全等同于天然皮肤，且普遍缺乏毛囊和其他附属器。本研究表明，EEP保留了广泛的早期附属器特征，包括协调的早期附属器程序和少量附属器高表达及后期毛囊支持细胞，并同时具备毛囊和外泌腺发育相关的早期转录特征。然而，当EEP转化为FTS后，在获得组织化分层表皮的同时，附属器相关状态大幅丧失。这一发育变窄伴随着两个关键特征：一是FTS上皮细胞呈现突出的反应性转录程序，表明上皮应激可能抑制附属器起始；二是FTS真皮与上皮间的通讯偏向FGF和细胞外基质信号，缺乏毛囊诱导所需的BMP和WNT输入以及上皮FGF20和SHH信号的协调输出，指示FTS真皮微环境无法提供基板形成所需的诱导信号。

研究结论指出，常规FTS构建产生了分层表皮，但同时降低了EEP中检测到的附属器相关程序。这种发育变窄与反应性上皮状态及偏离体内参照的发育性BMP和非经典WNT输入较弱的真皮-上皮信号配置相关联。这些发现表明，单纯的表皮分层并不能维持附属器形态发生所需的发育条件。未来模型开发应将上皮状态、发育时机和空间组织的上皮-间充质信号视为可分离变量，通过实验控制以实现稳健的表皮分层与附属器形态发生的结合。