《Frontiers in Microbiology》：Integrated microbiome and metaproteome analyses reveal microbial functions underlying traditional fermented amaranth stem fermentation
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发酵苋菜梗是一种中国传统发酵蔬菜，以其独特的刺激性风味和复杂的微生物生态为特征。本研究比较了来自安徽（AH）、江苏（JS）和浙江（ZJ）的样品，采用理化分析、挥发性物质谱分析、游离氨基酸测定、16S rRNA测序和宏蛋白质组学方法。三个地区的pH值范围为4.0
发酵苋菜梗是一种中国传统发酵蔬菜，以其独特的刺激性风味和复杂的微生物生态为特征。本研究比较了来自安徽（AH）、江苏（JS）和浙江（ZJ）的样品，采用理化分析、挥发性物质谱分析、游离氨基酸测定、16S rRNA测序和宏蛋白质组学方法。三个地区的pH值范围为4.08至4.39，总可滴定酸度为2.7至3.5 mL，活菌计数为7.7至8.6 log CFU/g，总挥发性物质浓度为99,021至332,864 μg/L。去除叶绿体和线粒体来源的序列后，厚壁菌门（约56–77%）和变形菌门（约23–40%）主导了细菌群落，其中乳杆菌属、乳球菌属和假单胞菌属为主要属。AH、JS和ZJ的总游离氨基酸浓度分别为888.5、778.0和582.0 μg/mL。宏蛋白质组学鉴定出7,158条独特蛋白质登录记录，其中3,926条获得了分类学归属。功能注释突出了碳水化合物代谢、能量代谢、应激反应功能和碳水化合物活性酶。这些结果表明，不同地区在细菌组成、表达功能和风味相关性状方面存在差异，并为未来靶向验证提供了候选微生物-功能关联。
研究背景、现存问题与研究目的
发酵蔬菜是全球重要的传统食品类别，发酵过程能够改善感官特性、延长货架期并重塑营养成分。在自然发酵过程中，源自原料、水源、器具及加工环境的土著微生物形成复杂的生态系统，乳酸菌常占据优势地位，而非乳酸菌和酵母也可能参与底物降解、有机酸代谢、香气形成及生态适应。因此，原料微生物群、盐浓度、温度、湿度、发酵时长及地方加工实践等因素会导致发酵蔬菜产品在微生物群落组成和代谢物谱上产生显著差异。近年来，多组学研究已从单纯的分类学描述转向将微生物组成与表达的功能及质量相关代谢物进行关联。
发酵苋菜梗是中国江浙地区特有的传统蔬菜产品，其自然发酵产生独特的刺激性香气和复杂滋味，同时将植物源碳水化合物和含氮化合物转化为有机酸、游离氨基酸和挥发性代谢物。已有研究利用宏基因组学、风味组学和代谢组学揭示了苋菜梗发酵过程中微生物组成和代谢物的显著时间变化，表明该系统比简单的乳酸菌主导发酵更为复杂。然而，现有研究主要关注单一发酵体系内的时间动态，不同产区之间的比较信息仍然匮乏，且尚不清楚不同产区的同类产品是否在表达的微生物功能上存在差异。宏基因组学虽能揭示群落结构和功能遗传潜力，但基因的存在并不一定意味着相应蛋白在特定发酵条件下表达。因此，研究人员采用宏蛋白质组学作为补充手段，直接表征混合微生物群落表达的蛋白质，从而探究活跃的代谢途径、酶系统、应激反应及底物互作。通过整合16S rRNA分析与宏蛋白质组学，旨在弥合“存在哪些微生物”与“正在表达哪些功能”之间的鸿沟。
基于此，本研究比较了来自中国安徽、江苏和浙江的传统发酵苋菜梗样品，通过理化性质、亚硝酸盐、活菌计数、挥发性化合物及游离氨基酸的表征来界定产品间的品质差异；利用16S rRNA基因测序评估细菌群落，并结合GO、KEGG、COG和CAZy注释的宏蛋白质组学来表征表达的功能蛋白；随后采用相关性网络探索优势菌属与功能类别之间的潜在关联。研究目标是通过整合品质性状、细菌群落谱和表达功能，识别区域相关的模式，并提出关于微生物组成、底物转化、酸化及风味形成的可检验假设，为未来受控发酵、品质评价及靶向机制验证提供参考。
关键技术方法
研究人员从中国安徽广德市、江苏苏州市和浙江宁波市各采集三份独立样品作为生物学重复。主要技术方法包括：采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用法检测挥发性有机化合物；使用L-8900型自动氨基酸分析仪测定游离氨基酸谱；针对16S rRNA基因V4区进行高通量测序，经去除叶绿体和线粒体序列后，基于SILVA 138数据库进行物种注释；采用改良苯酚法提取蛋白质，经液相色谱-串联质谱联用分析后，于MetaproteomicsDB数据库中进行蛋白质鉴定，并分别通过GO、KEGG、COG和CAZy数据库进行功能注释；最后基于九个个体样本的Spearman秩相关系数进行16S rRNA-宏蛋白质组学整合相关性分析。
研究结果
3.1 传统发酵苋菜梗的理化和微生物特征
三种区域产品表现出不同的理化和微生物特征。JS的pH最高而TTA最低，AH则相反。活菌计数AH显著高于JS和ZJ。氨基态氮含量从AH到JS和ZJ递增，亚硝酸盐含量均低于国标限量。
3.2 挥发性风味物质的区域差异
AH的总挥发性物质浓度最高，约为JS的2.29倍和ZJ的3.36倍，且检出的化合物种类更多。ZJ中乙酸的相对贡献较大，JS富集2-辛酮。此外，2,3-丁二醇异构体、苯甲醛衍生物、2-壬酮、水杨酸甲酯、丁香酚及含硫含氮化合物也存在区域差异。
3.3 发酵苋菜梗的游离氨基酸组成与呈味特性
总游离氨基酸浓度按AH > JS > ZJ递减，苦味氨基酸占比最大。AH总鲜味氨基酸水平最高，JS的谷氨酸单体浓度最高。色氨酸的区域差异最为明显，从AH到JS再到ZJ逐步降低。
3.4 微生物α多样性的区域差异
去除叶绿体和线粒体序列后，AH在Sobs、Shannon、Simpson和Pielou指数上与JS和ZJ存在显著差异，而JS与ZJ间无显著差异。
3.5 传统发酵苋菜梗的细菌群落组成
厚壁菌门和变形菌门为主导菌门。在属水平上，乳杆菌属、乳球菌属和假单胞菌属为主要菌属。AH中乳杆菌属丰度较高，JS和ZJ中乳球菌属丰度更高，ZJ还含有较高比例的丛毛单胞菌属、金黄杆菌属等。
3.6 发酵苋菜梗宏蛋白质组的功能注释
共鉴定出7,158条独特蛋白质登录记录，其中54.85%获得分类学归属，包括细菌、真菌、古菌和病毒蛋白。功能注释显示蛋白质主要与基础代谢和细胞过程相关，GO分类中催化活性和结合占分子功能的主要部分。KEGG注释凸显了全局代谢通路、碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢的主导地位。COG分类中翻译/核糖体结构生物发生最丰富，其次是翻译后修饰/蛋白周转/伴侣蛋白、碳水化合物运输与代谢等。CAZy注释中糖基转移酶和糖苷水解酶数量最多。
3.7 发酵苋菜梗功能蛋白谱的区域差异
GO分析显示JS在代谢过程、定位、细胞过程等功能上相对富集，ZJ则在刺激应答和生物调控信号上较强。KEGG分析中JS的糖酵解/糖异生、辅因子合成、氧化磷酸化等通路蛋白丰度较高，ZJ的乙醛酸和二羧酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化显著富集。COG谱中ZJ富集甘油摄取促进子和冷休克蛋白。CAZy分析中JS富集GT35、GT2等家族，ZJ显著富集GH68和GH70家族。
3.8 整合16S rRNA-宏蛋白质组学分析揭示潜在微生物-功能互作
相关性网络显示乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属与糖酵解/糖异生、核糖体、淀粉和蔗糖代谢紧密关联；假单胞菌属、黄杆菌属和马赛菌属与乙醛酸和二羧酸代谢及蛋白质加工相关。COG和CAZy网络中观察到与糖苷水解酶、糖基转移酶、碳水化合物结合模块和辅助活性家族的关联。
总结讨论与研究结论
讨论部分指出，这些相关性网络是基于九个个体样本计算的探索性微生物-功能关联，不能作为因果证据。研究存在的局限性包括：横断面设计仅涉及三个产区且每区三份样品，加工参数未标准化；16S rRNA测序仅表征细菌组分，真菌群落组成未直接解析；微生物-宏蛋白质组网络为相关性基础，无法建立特定类群、蛋白与风味形成之间的因果关系；未开展靶向酶活测定、同位素/代谢物示踪及受控接种实验。研究结论强调，传统发酵苋菜梗在不同产区不仅细菌群落组成存在差异，表达的宏蛋白质组功能和风味相关性状亦不相同。16S rRNA-宏蛋白质组联合框架揭示了优势细菌、碳水化合物活性酶、中心代谢与风味前体转化之间的合理关联，这些关联应被视为机制性假设而非因果证据。通过界定有待靶向验证的功能特征并识别需加强过程控制的关键变异来源，本研究为未来旨在理解和改进发酵苋菜梗品质一致性的受控研究奠定了基础。
