木材烟雾颗粒物经Sprouty2依赖性机制诱导小鼠嗜酸性粒细胞性哮喘

《Frontiers in Allergy》：Wood smoke fire particulate matter induces eosinophilic asthma in a Sprouty2-dependent manner in mice

　　

摘要专业翻译 木材烟雾颗粒物（wood smoke particulate matter，WSP）是一项重要的公共卫生危害。本研究旨在建立WSP诱导的气道炎症与气道高反应性小鼠模型。WSP已被证实与一个调控ERK1/2调节因子Sprouty2（Spry2）表达的遗传风险变异体相关联。研究人员在可诱导性Spry2基因敲除小鼠中，探讨了Spry2在WSP诱导的气道病理及关键免疫细胞活化中的重要性。对 na?ve B6 小鼠进行短期气道暴露于WSP，可诱导对乙酰甲胆碱（methacholine）的气道高反应性，以及嗜酸性粒细胞性炎症（程度较轻的还有适度中性粒细胞性炎症）、黏液产生和气道重塑。上述病理异常的诱导与2型固有淋巴样细胞（ILC2s）和CD4?T细胞数量增加、ERK1/2磷酸化增强以及IL5、IL13和IL17A产生增多相关。诱导性敲除Spry2可阻止气道高反应性、气道炎症、黏液产生、胶原沉积及ERK1/2磷酸化的诱导。Spry2缺失（Spry2?/?）抑制了ILC2数量的增加，但不影响CD4?T细胞频率。在缺乏Spry2的情况下，ILC2s和Th2细胞中的ERK1/2磷酸化均受到抑制。Spry2缺失减少了表达IL5、IL13和IL17A的ILC2s。同样，Spry2缺失也减少了CD4?T细胞中IL17A和IL13的产生，但不影响IL5的产生。研究人员得出结论：WSP可诱导嗜酸性粒细胞性及轻度中性粒细胞性气道炎症，并呈现哮喘的其他特征。Spry2在WSP诱导的气道病理中发挥非冗余作用，部分通过促进ERK1/2活化实现。

论文解读

一、研究背景与科学问题

野火（wildfire）在气候变化与传统森林管理策略遗留问题的双重驱动下，正日益成为全球重大公共卫生关切。木材烟雾颗粒物（wood smoke particulate matter，WSP）是空气污染物的复杂混合物，包含大量细颗粒物（空气动力学直径≤2.5 μm，即PM_2.5）、碳氧化物、氮氧化物、有害空气污染物、水蒸气及微量其他化合物。暴露于WSP与呼吸系统疾病风险增加相关，包括肺功能受损以及哮喘、慢性阻塞性肺疾病和呼吸道感染的急性加重。研究显示，由野火烟雾来源的PM_2.5导致的呼吸系统并发症可使医院及急诊就诊率增加27%。近期研究提示，遗传因素可能促成WSP暴露背景下的哮喘风险，并鉴定出Sprouty2（Spry2）是响应野火PM_2.5而促进哮喘风险的介质。

Sprouty（Spry）蛋白最初在果蝇中被发现，是成纤维细胞生长因子（FGF）诱导的气管分支的抑制剂。Spry蛋白广泛表达，哺乳动物中至少鉴定出4个Spry同源物（Spry1至Spry4），其中Spry3表达局限于脑和睾丸。后续研究证实Spry蛋白在多种生长因子下游抑制RTK/Ras/ERK通路。Spry的抑制功能具有细胞和配体特异性，因其能与Ras/ERK1/2信号通路中的关键信号分子（如Grb2、Shp2、Raf、Sos1、TESK和FRS2）相互作用。另一方面，Spry2也被证实可通过阻止c-cbl介导的EGF受体降解来增强ERK活化。研究人员近期发现Spry2在TCR触发的ERK1/2磷酸化中发挥正性调控作用，Spry2缺失导致T细胞中ERK磷酸化减少。综上，Spry2在不同情境和细胞类型中既可作为ERK1/2活化的正调控因子，也可作为负调控因子。

ERK1/2信号在Th2分化和过敏性气道炎症中发挥重要作用。研究人员此前已证实Spry2缺陷导致CD4?T细胞中ERK磷酸化缺陷，并减弱对过敏原（烟曲霉）的过敏性气道炎症反应。基于上述背景，研究人员旨在探究Spry2是否在WSP诱导的气道炎症中发挥作用，以及Spry2缺失是否导致暴露于WSP的免疫细胞中ERK1/2磷酸化减少。

二、研究设计与主要结论

研究人员建立了WSP诱导的小鼠急性哮喘模型，利用他莫昔芬（Tamoxifen）诱导的ERT2-Cre系统实现Spry2的全球性诱导敲除，对Spry2^+/+和Spry2^?/?雌性小鼠进行为期两周的WSP鼻内攻毒（第一周连续5天，第二周隔天），并于最后一次攻毒后2天检测气道高反应性（airway hyperreactivity，AHR）、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage，BAL）细胞分类、肺组织病理学及免疫细胞应答。

研究得出以下核心结论：短期气道暴露于WSP可诱导气道高反应性、以嗜酸性粒细胞为主（伴轻度中性粒细胞）的气道炎症、黏液产生和气道重塑；Spry2诱导性缺失可完全消除WSP诱导的气道高反应性、炎症、黏液产生及胶原沉积；Spry2缺失抑制ILC2数量增加但不影响CD4?T细胞频率；Spry2缺失抑制ILC2s和Th2细胞中的ERK1/2磷酸化；Spry2缺失减少ILC2s中IL5、IL13和IL17A的表达，以及CD4?T细胞中IL13和IL17A（而非IL5）的表达。研究证实Spry2在WSP诱导的气道病理中发挥非冗余作用，部分通过促进ERK1/2活化实现。

三、关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：①他莫昔芬诱导的ERT2-Cre:Spry2^f/f小鼠模型实现Spry2的全球性诱导敲除，并以他莫昔芬处理的Spry2^f/f小鼠作为对照；②WSP暴露动物模型，所用WSP由美国环境保护署实验室Andrew Ghio博士提供，通过电加热元件加热白橡木在木柴炉中产生，平均粒径为0.14微米；③flexiVent小动物呼吸机进行侵入性肺功能检测以评估气道高反应性；④BAL细胞分类计数（Diff Quik染色）；⑤肺组织H&E染色评估炎症、PAS染色评估黏液产生、Masson三色染色评估胶原沉积，并通过形态计量学软件定量分析；⑥流式细胞术检测肺单细胞悬液中CD4?T细胞和ILC2s的表面标志、胞内细胞因子（IL5、IL13、IL17A）及p-ERK表达；⑦Western blot验证Spry2蛋白敲除效率。

四、研究结果

1. Spry2缺失对WSP诱导的AHR和BAL炎症细胞浸润的影响

研究人员首先通过Western blot证实了他莫昔芬诱导的Spry2全球性敲除。随后，对Spry2^+/+和Spry2^?/?小鼠进行WSP或生理盐水鼻内攻毒。flexiVent肺功能检测显示，WSP攻毒的Spry2^+/+小鼠总气道阻力显著升高，而WSP攻毒的Spry2^?/?小鼠气道阻力较Spry2^+/+-WSP组显著降低。BAL细胞分类计数显示，Spry2缺失显著抑制了WSP诱导的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润。结果表明Spry2参与WSP诱导的气道阻力增加和BAL炎症细胞浸润。

2. Spry2缺失对WSP诱导的支气管周围和血管周围炎症的影响

肺组织病理学分析显示，WSP反复攻毒导致Spry2^+/+小鼠肺组织出现广泛的支气管周围和血管周围炎症，而Spry2^?/?小鼠的炎症细胞积聚显著减少（H&E染色）。PAS染色显示Spry2^+/+小鼠出现杯状细胞化生增加，而Spry2^?/?小鼠的杯状细胞化生被严重削弱，提示黏液产生和IL13诱导反应减少。Masson三色染色显示，与生理盐水对照组类似，WSP处理的Spry2^?/?小鼠胶原沉积较WSP暴露的Spry2^+/+小鼠减少。结果表明Spry2参与WSP诱导的支气管周围和血管周围炎症、黏液产生、杯状细胞增生和胶原沉积。

3. Spry2缺失对WSP诱导的CD4?T细胞应答的影响

流式细胞术分析显示，WSP暴露的两组小鼠肺中CD4?T细胞百分比相当。但Spry2缺陷的CD4?T细胞中ERK磷酸化较Spry2充足的CD4?T细胞显著降低。胞内细胞因子染色显示，WSP暴露的Spry2^+/+和Spry2^?/?小鼠中表达IL5的CD4?T细胞比例相当，但Spry2缺陷小鼠中IL13?和IL17A?CD4?T细胞显著减少。结果表明Spry2缺失导致CD4?T细胞中ERK1/2磷酸化、IL13和IL17A表达降低，但不影响IL5表达。

4. Spry2缺失对WSP诱导的ILC应答的影响

流式细胞术分析显示，Spry2缺陷导致Lin^?CD45?CD25?ILCs数量较Spry2充足小鼠显著减少。Spry2^?/?小鼠中ERK1/2磷酸化及表达p-ERK的ILCs百分比也显著降低。胞内细胞因子染色显示，Spry2^?/?小鼠中表达IL5、IL13和IL17A的ILCs百分比均较Spry2^+/+小鼠显著减少。结果表明Spry2缺失导致ILCs中ERK1/2磷酸化及IL5、IL13和IL17A表达降低。

五、讨论与结论

本研究证实，对na?ve小鼠进行短期鼻内WSP暴露可诱导气道高反应性、支气管周围和血管周围炎症（以嗜酸性粒细胞为主、伴轻度中性粒细胞）、黏液产生和气道重塑，该表型完全依赖于Spry2信号，因为Spry2基因的诱导性缺失可完全消除上述病理改变。WSP诱导的ERK1/2活化在Spry2^?/?的ILC2s和CD4?T细胞中受到抑制，进而抑制了ILCs中2型和3型细胞因子的产生。

关于作用机制，WSP可诱导上皮细胞产生IL-24，IL-24通过STAT1/STAT3信号下调occludin和ZO-1表达，损害屏障功能并增加通透性，这些上皮异常通常引发2型免疫应答。IL-24促进IL-33分泌，而IL-33是ILC2s、Th2细胞及其他促进嗜酸性粒细胞炎症细胞的主要激活因子。IL-24和IL-33均可激活ERK1/2信号。Spry2可能通过增强ERK1/2活化来促进WSP诱导的IL-24炎症反应；在Spry2缺失时，ERK1/2活化受损，过敏性表型消失。

值得注意的是，Spry2通常被视为受体酪氨酸激酶信号（尤其是ERK1/2信号）的通用抑制剂，但在WSP刺激条件下，Spry2发挥的是ERK1/2活化增强因子的功能。研究人员此前的基因敲除模型已验证了这一范式。

在公共卫生意义方面，木材燃烧在许多发展中国家是家庭烹饪和取暖的燃料来源，WSP也是这些国家常见的室内污染。野火和WSP的不良健康效应已成为重大公共卫生关切。Gupta等人已鉴定出52个与WSP基因组应答共定位的遗传风险变异体，其中rs3861144变异与哮喘相关（优势比=1.036），该变异改变气道上皮细胞中Spry2对WSP的应答。因此，携带rs3861144风险变异的个体可能对野火烟雾和WSP污染空气暴露更为易感。除减少暴露外，明确WSP有害效应的分子通路对于开发直接针对这一公共卫生威胁的疗法、进一步减少不良健康效应至关重要。

本研究提供了WSP驱动的小鼠急性哮喘模型的免疫学后果，证明WSP是2型实验性哮喘的诱导剂，Spry2是气道对WSP应答的关键调控因子。