解冻后培养时长对不同发育阶段胚胎冻融移植活产结局的差异化影响：一项回顾性队列研究

《Frontiers in Physiology》：The impact of post-thaw culture time on clinical outcomes of embryos at different developmental stages

　　

目的：本研究旨在探讨解冻后胚胎培养时间对不同发育阶段胚胎临床结局的影响。方法：本研究采用回顾性分析设计，将冻融胚胎移植（FET）周期分为四个亚组：单卵裂期胚胎移植周期、双卵裂期胚胎移植周期、单囊胚移植周期和双囊胚移植周期。采用单因素和多因素分析评估各亚组内解冻后培养时间对活产率、出生胎龄、出生体重和出生身长的影响。活产率被定义为主要结局。结果：在双卵裂期胚胎移植周期（n=936）中，<4 h解冻后胚胎培养组的活产率（45.1%）显著低于≥4 h组（57.2%），P=0.001。在多因素回归模型中校正混杂因素后，解冻后培养时间仍与活产率显著相关（P=0.008），校正比值比（OR）（95%置信区间[CI]）为1.524（1.117–2.081）。在单囊胚移植周期（n=688）中，<4 h解冻后胚胎培养组的活产率（47.2%）显著高于≥4 h组（34.3%），P=0.017。校正混杂因素后，解冻后培养时间仍与活产率保持显著相关（P=0.003），校正OR（95% CI）为0.493（0.308–0.788）。检测到具有统计学意义的交互作用（校正交互OR=0.424，95% CI 0.272–0.663，P<0.001），证实解冻后培养时间对活产率的影响在卵裂期胚胎与囊胚期胚胎之间存在差异。结论：解冻后培养时间显著影响双卵裂期胚胎移植周期和单囊胚移植周期的活产率，且该影响随胚胎发育阶段而变化。

研究背景与问题：玻璃化冷冻（vitrification）可显著提高胚胎存活率，使冻融胚胎移植（FET）在辅助生殖技术（ART）中的应用日益广泛；多项多中心试验显示冻融胚胎移植在活产率和安全性方面具有优势。解冻后胚胎从复苏到移植前需在体外培养一段时间，但最佳时长仍有争议：卵裂期胚胎有研究支持短时培养，也有研究支持延长至囊胚；囊胚期胚胎亦存在延长培养是否改善选择的争论。既往研究在培养时长、结局指标、胚胎质量和移植胚胎数控制方面不一致。为此，研究人员按胚胎发育阶段和移植胚胎数分层，评估解冻后培养时间对活产率及围产结局的影响。

关键技术方法：单中心回顾性队列来源为本机构2018年9月至2023年10月的FET周期，按单卵裂期、双卵裂期、单囊胚和双囊胚移植分为四个亚组；纳入卵裂期1–2级或囊胚≥3BB且为本中心首次移植的周期，双胚胎移植要求两枚胚胎同时解冻、同一培养间隔并符合质量标准；排除子宫畸形、卵裂期培养至囊胚、后续FET、复苏后评级不达标或明显凋亡、囊胚内细胞团（ICM）/滋养外胚层（TE）为C级及复苏后未再扩张且>50%细胞凋亡等。采用玻璃化冷冻/解冻、复苏后培养（37 °C、6% CO₂、5% O₂、89% N₂）、内膜准备和胚胎形态学评分；以单因素及多因素二元logistic回归和线性回归分析，主要结局为活产。

研究结果：
1. 解冻后培养时间的总体分布：培养时间为0.1–8.7 h，均值±标准差为3.1±1.9 h；频率分布约以4 h为界，故将周期分为<4 h组和≥4 h组。通过分布分析确定分组阈值。
2. 单卵裂期胚胎移植周期：单因素分析显示女性年龄和男性年龄影响活产，解冻后培养时间无显著影响；<4 h组活产率为25.0%，≥4 h组为30.0%；校正女性年龄、女性不孕时长、女性体质指数（BMI）和男性年龄后，培养时间仍与活产无显著关联。通过单因素和多因素logistic回归得出。
3. 双卵裂期胚胎移植周期：<4 h组活产率为45.1%，≥4 h组为57.2%，P=0.001；校正混杂因素后，解冻后培养时间仍与活产率显著相关，P=0.008，校正OR为1.524（95% CI 1.117–2.081）。通过单因素和多因素分析得出≥4 h与较高活产率相关。
4. 单囊胚移植周期：<4 h组活产率为47.2%，≥4 h组为34.3%，P=0.017；校正女性年龄、女性不孕类型与时长、女性BMI、内膜厚度、男性年龄、男性不孕类型与时长后，培养时间仍与活产率显著相关，P=0.003，校正OR为0.493（95% CI 0.308–0.788）。通过单因素和多因素分析得出<4 h与较高活产率相关。
5. 双囊胚移植周期：<4 h组活产率为55.2%，≥4 h组为46.1%，差异无统计学意义；校正混杂因素后，解冻后培养时间与活产无显著关联。通过单因素和多因素分析得出。
6. 合并交互作用与次要结局：合并四亚组的多因素回归检测到解冻后培养时间与胚胎发育阶段的交互作用显著（校正交互OR=0.424，95% CI 0.272–0.663，P<0.001），说明培养时间对活产率的影响在卵裂期与囊胚期不同；探索性分析评估出生胎龄、出生体重和出生身长，仅在单卵裂期胚胎移植周期中观察到培养时间对出生胎龄有显著影响（n=23），但样本量小，需扩大样本验证；临床妊娠率、流产率和多胎妊娠率等其他次要生殖结局亦被分析。

讨论总结：讨论指出，宫内环境通常优于体外环境，但玻璃化解冻可能损伤胚胎，复苏后需在稳定环境中恢复；既往延长培养虽有成功经验，但样本量统计验证不足。研究人员将<4 h与≥4 h比较，并按胚胎发育阶段和移植胚胎数分组，以减少移植胚胎数和发育阶段对结局的偏倚。双卵裂期结果与既往报告不一致，可能与既往延长培养达18–20 h以上且多以临床或持续妊娠为结局，而本研究延长范围为4–8.7 h并以活产为主要结局有关；延长至囊胚的研究虽支持延长，但可能因排除不能发育至囊胚的胚胎而产生偏倚。单囊胚结果与部分既往研究不一致，可能与周期筛选、分组方法、胚胎质量排除和冷冻技术差异有关。局限性包括回顾性设计，缺少取卵时女性年龄、冻存时长、囊胚玻璃化日、具体形态学等级、复苏后囊胚再扩张状态、受精方式、不孕诊断、既往移植次数、移植年份、移植医生和胚胎移植日时间等参数；单卵裂期样本量较小；双囊胚≥4 h组周期数较少。

研究结论部分翻译：本研究显示，在所考察的解冻后胚胎培养时间范围（0.1–8.7 h）内，解冻后培养时间与双卵裂期胚胎移植周期和单囊胚移植周期的活产率显著相关；解冻后培养时间对活产率的影响因胚胎发育阶段而异。这些发现为确定不同胚胎移植策略的最佳解冻后培养时间提供了临床指导。