基于测序信息的患者特异性液滴数字PCR循环肿瘤DNA监测在复发或转移性头颈癌中的应用：一项初步研究

《Frontiers in Oncology》：Sequencing-informed, patient-specific droplet digital PCR assays for circulating tumor DNA monitoring in recurrent or metastatic head and neck cancer: a pilot study

背景： 在复发或转移性头颈鳞状细胞癌（R/M HNSCC）中，由于影像学检查可能延迟或被治疗相关改变及免疫治疗下的非典型反应模式所混淆，早期识别治疗反应仍具挑战性。系列循环肿瘤DNA（ctDNA）分析可能提供一种微创的肿瘤动态评估手段，并补充传统影像学检查。研究人员因此探讨了基于患者特异性液滴数字PCR（ddPCR）的ctDNA监测的可行性及其临床相关性。 方法： 九例R/M HNSCC患者作为常规临床诊疗的一部分，接受了FoundationOne? CDx肿瘤基因组分析。研究人员选取患者特异性单核苷酸变异（SNV），包括致病性或可能致病性变异以及技术上适合的未知意义变异（VUS），用于ddPCR检测方法的开发。在全身治疗前和/或治疗期间采集血浆样本，并评估ctDNA动力学与影像学反应、无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）的关系。 结果： 研究人员成功建立了16个单靶点ddPCR检测方法，并将其组合成十个患者特异性的单靶点或多靶点检测配置。共分析了21份血浆样本，所有样本均获得技术有效的测量结果。七例患者有治疗前血浆样本，其中三例（42.9%）检测到ctDNA。在所有时间点中，九例患者中有六例（66.7%）至少一次检测到ctDNA。在六例接受系列采样的患者中，五例（83.3%）的ctDNA动力学与影像学评估呈描述性一致。唯一一例ctDNA升高的患者出现疾病进展，而ctDNA下降或稳定的四例患者分别表现为部分缓解或疾病稳定；一例患者表现为混合性影像学反应。在一项探索性描述性比较中，唯一一例ctDNA升高的患者观察到的PFS和OS短于五例ctDNA下降或稳定的患者。鉴于该组仅有一例患者，这一观察结果仅为假设生成性质，尚不能确立预后关联。 结论： 基于患者特异性ddPCR的ctDNA监测在技术上可行，且在大多数可评估患者中与影像学评估一致。这些概念验证性发现支持在R/M HNSCC中前瞻性评估患者特异性ddPCR作为纵向监测的聚焦方法；其比较性临床效用和成本效益仍有待确立。

一、研究背景与目的

头颈鳞状细胞癌（HNSCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一。尽管多模式根治性治疗取得进展，仍有相当比例的患者发生局部区域复发或远处转移。在复发或转移性（R/M）HNSCC中，靶向程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡配体1（PD-1/PD-L1）轴的免疫检查点抑制剂（ICI）已成为全身治疗的重要组成部分。然而，持久临床获益仅限于部分患者，可靠的早期治疗反应评估生物标志物仍缺乏。目前治疗反应主要依靠计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）和¹⁸F-FDG正电子发射断层扫描/CT（PET/CT）评估。但影像学判读可能因治疗相关炎症、纤维化及其他治疗后组织改变而复杂化，其对小体积或微转移病灶的敏感性也可能不足。在接受免疫治疗的患者中，非典型反应模式（包括假性进展）可能被常规实体瘤疗效评价标准（RECIST）误判为疾病进展。因此，需要能够补充影像学并更早、更动态地反映疾病活动的生物标志物。

循环肿瘤DNA（ctDNA）作为循环中肿瘤来源的无细胞DNA组分，已发展为微创"液体活检"手段，在分子分型、微小残留病（MRD）检测和纵向治疗反应监测方面具有潜在应用价值。近年支持ctDNA监测在HNSCC中应用的证据不断增加。多项研究表明，免疫检查点抑制剂治疗期间ctDNA水平的早期变化与后续临床结局相关。ctDNA下降或清除与影像学缓解及更长的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）相关，而ctDNA稳定或升高通常与治疗耐药和不良结局相关。然而，许多研究采用基于二代测序（NGS）的方法，其频繁纵向监测可能受限于成本、周转时间、测序要求和专业化生物信息学分析需求。

液滴数字PCR（ddPCR）为监测预定义肿瘤特异性变异提供了一种聚焦性替代方案。它能够利用相对少量的血浆来源DNA实现快速、高灵敏度的绝对定量，且资源消耗可能低于广泛测序方法，适合治疗期间重复测量。尽管ddPCR在HNSCC血浆ctDNA定量中的可行性已被证实，但基于患者特异性ddPCR的纵向ctDNA监测在R/M HNSCC中仍相对研究不足。本探索性研究在九例接受全身治疗的R/M HNSCC患者中评估了患者特异性ddPCR-based ctDNA监测的可行性，并将系列ctDNA动力学与影像学反应和临床病程进行比较。

二、主要技术方法

研究人员利用FoundationOne^? CDx对九例R/M HNSCC患者的肿瘤组织进行全面的基因组分析（CGP）。基于测序结果，为每例患者选择1至3个患者特异性单核苷酸变异（SNV），包括致病性或可能致病性变异以及技术上适合的未知意义变异（VUS），用于ddPCR检测方法开发。使用Beacon Designer软件设计患者特异性引物和LNA修饰的水解探针，在Naica^TM Crystal Digital PCR系统上先建立单靶点ddPCR检测方法，验证扩增效率、探针特异性和等位基因区分能力后，将优化的单靶点检测组合成患者特异性多靶点检测。使用合成双链DNA片段（gBlocks^TM Gene Fragments）作为野生型和突变型靶序列对照进行检测方法开发和分析评估。血浆样本来自苏黎世大学医院肿瘤内科和血液科，在治疗前和/或治疗期间的非固定时间点采集。细胞游离DNA（cfDNA）使用MagMAX^TM Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit在KingFisher^TM Flex仪器上从5 mL血浆中提取。数字PCR扩增在Naica^TM Geode仪器上进行，芯片在Naica^TM Prism3荧光读取器上成像，使用Crystal Miner软件基于泊松统计自动计算靶标浓度。

三、研究结果

3.1 患者特征

研究纳入九例经临床和组织病理学确诊的R/M HNSCC患者，均为男性，复发或转移性疾病诊断时中位年龄65岁（四分位距[IQR]，56–75岁；范围49–79岁）。最常见的原发部位是口咽部（4/9；44.4%），其中三例HPV阴性、一例HPV阳性；其次为鼻咽部（2/9；22.2%），包括一例EBV阳性和一例EBV阴性。其余患者原发肿瘤分别位于下咽部、上颌窦和喉部（各1/9；11.1%）。中位累计烟草暴露量为30包年（IQR，5–40包年）。研究纳入时，四例患者（44.4%）仅表现为局部区域复发，四例（44.4%）仅表现为远处转移性疾病，一例（11.1%）同时存在局部区域复发和远处转移。监测期间接受的全身治疗具有异质性：四例接受帕博利珠单抗单药治疗，一例接受帕博利珠单抗联合卡铂和5-氟尿嘧啶，其余患者分别接受卡铂联合吉西他滨、西妥昔单抗联合多西他赛、或顺铂联合多西他赛和5-氟尿嘧啶。总体而言，五例患者（55.6%）接受了含帕博利珠单抗的方案。最终分析时，九例患者中七例（77.8%）已死亡。

3.2 基线全面基因组分析

九例患者均成功完成FoundationOne^? CDx基线全面基因组分析。七例患者（77.8%）的测序基于转移灶组织，包括五例淋巴结转移、一例脑转移和一例肺转移；其余两例分析局部肿瘤组织。分析标本的中位肿瘤细胞含量为60%（95% CI，40–75%；范围20–85%）。所有肿瘤均为微卫星稳定型。中位肿瘤突变负荷为5 Mutations/Mb（95% CI，2–8；范围1–10）。每份标本中位检出3个致病性或可能致病性基因组改变（范围1–12）。全部九份标本共报告49个致病性或可能致病性改变，其中14个（28.6%）为单核苷酸变异（SNV），对应每份标本中位2个SNV（范围0–3）。两例患者的标本中未检出致病性或可能致病性SNV。此外，每份标本中位报告9个未知意义变异（VUS）（95% CI，5-15；范围3–16）。

3.3 患者特异性ddPCR检测方法的建立

基于FoundationOne^? CDx结果，共选择16个患者特异性SNV用于ddPCR检测方法开发，对应每例患者中位2个变异（范围1–3）。九个变异（56.3%）分类为致病性或可能致病性，七个（43.8%）分类为VUS。五例患者选择两个变异，三例患者选择一个变异，一例患者选择三个变异。五例患者至少有一个致病性或可能致病性SNV可用，而四例患者选择的靶标完全由VUS组成。TP53是所选变异中最常代表的基因（n=3），其次是PIK3CA（n=2）。全部16个所选SNV均成功建立单靶点ddPCR检测方法，技术建立成功率为100%。单靶点检测优化后，在有两个合适变异的患者中组合成多靶点检测。由于三色荧光检测格式的限制，每个多靶点反应最多包含两个突变靶标。最终共使用十个ddPCR反应配置用于九例患者。

3.4 系列ctDNA评估的可行性

共从九例患者获得21份血浆样本，对应每例患者中位2份样本（范围1–4）。六例患者（66.7%）有系列血浆样本（定义为每例至少两份），三例患者仅提供单份血浆样本。中位观察期从研究纳入至最后一次血浆采集为9.0周（IQR，5.2–10.4；范围0–26.4）。全部21份血浆样本均成功处理，每份样本均获得技术有效的ddPCR测量结果（100%）。七例患者有治疗前血浆样本，其中三例（42.9%）在治疗开始前检测到ctDNA，其余四例（57.1%）在所用检测条件下未检测到ctDNA。三例治疗前ctDNA可检测的患者中，两例有远处转移性疾病，一例仅有局部区域复发。考虑所有采样时间点时，九例患者中六例（66.7%）至少一次检测到ctDNA，包括三例随访期间样本阳性的患者。其余三例（33.3%）在整个观察期内未检测到ctDNA。纵向样本的纳入增加了可检测到肿瘤来源变异的患者数量。

3.5 ctDNA动力学与临床和影像学结局的关联

首次再分期时，八例患者接受FDG PET/CT检查，一例接受颈部、胸部和腹部CT检查。从治疗开始到首次再分期中位间隔66天（IQR，57–100；范围53–119）。在六例有系列血浆采样的患者中，五例（83.3%）的ctDNA动力学与影像学治疗评估一致。唯一一例ctDNA水平升高的患者出现影像学确认的疾病进展。五例ctDNA下降或稳定的患者中，两例影像学达到部分缓解，两例疾病稳定。其余一例表现为混合性影像学反应，是分子评估与影像学评估之间唯一不一致的病例。在一项探索性Kaplan–Meier分析中，ctDNA升高组唯一一例患者的PFS和OS短于五例ctDNA下降或稳定的患者（名义log-rank P = 0.0253）。鉴于组间规模高度不平衡，ctDNA升高组仅一例患者，这些P值应谨慎解读，不能确立预后关联。由于生存结局完全分离，无法获得可靠的Cox比例风险估计。

四、讨论与结论

本初步研究证明了患者特异性ddPCR-based ctDNA监测在R/M HNSCC中的技术可行性。所有选定的SNV均成功建立检测方法，所有血浆样本均成功分析，三分之二的患者至少一次检测到ctDNA。在六例有系列采样的患者中，五例ctDNA动力学与影像学评估呈描述性一致。这些发现与日益增多的证据一致，表明纵向ctDNA动力学可能比单次治疗前测量更具临床信息价值。治疗前ctDNA检出率为42.9%，低于文献报道的肿瘤不可知检测方法（80%）和肿瘤知情检测方法（86%），可能归因于较低的肿瘤负荷、检测方法设计和分析灵敏度的差异。值得注意的是，随访期间另外三例患者首次检测到ctDNA，表明系列采样可识别额外患者。将VUS纳入靶标选择使得每例患者至少有一个可追踪位点。该研究的局限性包括样本量小、单中心、采样时间点非标准化、未建立正式的检测方法特异性空白限（LoB）和检出限（LoD）、未进行配对白细胞测序以排除种系来源和克隆性造血。生存分析结果仅由一例患者驱动，应视为假设生成性质。总体而言，这些概念验证性发现支持在更大队列中采用标准化采样计划、正式分析验证和预定义分子反应标准进行前瞻性评估。