《Frontiers in Endocrinology》：Plasma proteomics identifies four candidate biomarkers associated with macrovascular complications in type 2 diabetes: evidence from a clinical cohort and an animal model
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目的： 通过蛋白质组学筛选、临床验证及动物模型，识别并验证T2DM大血管并发症的血浆蛋白生物标志物。
方法： 采用血浆蛋白质组学（4D-DIA，每组n=6）通过差异表达分析、WGCNA及PPI分析筛选候选蛋白。在一个独立临床队列（n=162：41例健康对照、3
目的： 通过蛋白质组学筛选、临床验证及动物模型，识别并验证T2DM大血管并发症的血浆蛋白生物标志物。
方法： 采用血浆蛋白质组学（4D-DIA，每组n=6）通过差异表达分析、WGCNA及PPI分析筛选候选蛋白。在一个独立临床队列（n=162：41例健康对照、35例单纯T2DM、86例T2DM合并大血管并发症）中通过ELISA验证候选蛋白与代谢参数的相关性及诊断效能。建立糖尿病动脉粥样硬化小鼠模型（每组n=10；对照组和糖尿病组为C57BL/6J小鼠，糖尿病动脉粥样硬化组为ApoE-/-小鼠，共24周），通过Western blot、RT-qPCR、组织学及免疫组化评估蛋白/mRNA表达及动脉粥样硬化病变，并分析与炎症及代谢标志物的相关性。
结果： 在探索性蛋白质组学发现阶段（每组n=6的小型队列），优先筛选出四种候选蛋白：腺苷酸琥珀酸裂解酶（ADSL）、半乳糖凝集素-3（LGALS3）、甘露糖基(α-1,3-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（MGAT1）及含V-set和免疫球蛋白结构域蛋白4（VSIG4）。四蛋白组合显示出良好的区分能力（AUC=0.961）。将该组合加入临床模型（年龄、病程及HbA1c）后显著提升了诊断性能（ΔAUC=0.138，P=0.008；NRI=0.314；IDI=0.261），具有良好的校准度及内部稳定性。Firth惩罚逻辑回归确定ADSL（OR=0.327，P=0.0199）和MGAT1（OR=7.435，P=2.71×10–6）与流行的大血管疾病独立相关。在动物模型中，ADSL、LGALS3及VSIG4与七项指标显著相关，而MGAT1经FDR校正后与LDL-C、HDL-C、IL-6及TNF-α显著相关。LGALS3和VSIG4在多变量分析中虽非独立因素，但表现出一致的上调及中等区分能力（AUC分别为0.736和0.686），支持其生物学相关性。
结论： ADSL和MGAT1与流行的大血管并发症独立相关。LGALS3和VSIG4可能反映累积的代谢和炎症负荷而非缺乏生物学相关性；动物研究为该假说提供了支持性证据。四蛋白组合在临床变量基础上改善了诊断区分能力。这些发现基于小型发现队列及内部验证，具有探索性；因此这四种蛋白最佳被视为与流行疾病相关的候选诊断生物标志物。有必要进行前瞻性外部验证。
论文解读文章
研究背景与目的
2型糖尿病（T2DM）是一种以胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能进行性下降为特征的慢性代谢性疾病。随着人口老龄化、生活方式西化及肥胖率持续上升，T2DM已成为全球疾病负担增长最快的慢性病之一。据国际糖尿病联盟（IDF）数据，2021年全球20-79岁成人糖尿病患病率达10.5%（约5.366亿人），预计至2045年将升至12.2%（约7.832亿人），其中中国糖尿病患者数量居全球首位。除高血糖本身导致的代谢异常外，各类慢性并发症——尤其是心脑血管并发症——已成为影响患者生活质量及长期预后的主要因素。T2DM大血管并发症主要表现为冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑卒中及外周动脉疾病，其病理基础为加速且弥漫的动脉粥样硬化。然而，其发病机制复杂，涉及多条信号通路及多种细胞类型的协同调控，至今尚未完全阐明。尽管近年来影像学检查及危险因素评估体系不断完善，T2DM大血管并发症的识别仍面临重大挑战。传统生物标志物（如血脂谱、炎症因子、内皮损伤标志物）在敏感性和特异性方面均存在一定局限性，难以满足诊断分层及个体化管理需求。因此，识别具有高诊断性能及临床转化潜力的新型生物标志物成为糖尿病并发症研究的关键焦点。本研究旨在通过蛋白质组学筛选、独立临床队列验证及动物模型验证的系统性研究策略，筛选并验证与T2DM大血管疾病密切相关的关键蛋白，评估其作为流行性大血管并发症候选诊断生物标志物的价值。
研究方法与技术路线
本研究采用发现队列筛选、临床独立队列验证及动物模型验证相结合的设计。关键技术方法包括：①蛋白质组学发现阶段：使用4D-DIA（diaPASEF）定量蛋白质组学技术对血浆样本进行高通量分析，通过差异表达分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析筛选关键候选蛋白。②临床验证阶段：建立独立临床验证队列（n=162，来自安徽医科大学附属省立医院2025年3月至2026年3月期间招募的受试者，包括41例健康对照、35例单纯T2DM及86例T2DM合并大血管并发症），采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测候选蛋白表达水平，分析其与临床指标的相关性及诊断效能。③动物验证阶段：建立糖尿病动脉粥样硬化小鼠模型（C57BL/6J小鼠用于正常对照和糖尿病组，ApoE-/-小鼠用于糖尿病动脉粥样硬化组，高脂饮食联合链脲佐菌素诱导，持续24周），从组织病理学、蛋白表达及基因转录三个层面提供支持性证据，并分析目标蛋白与生化及炎症标志物的相关性。
研究结果
蛋白质组学发现阶段：
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差异丰度蛋白分析：与Pro-NC相比，Pro-DM检出121种差异丰度蛋白（DAP）（35种上调，86种下调），Pro-DA检出134种（44种上调，90种下调）。两组糖尿病组间有69种蛋白重叠，提示存在追踪糖尿病进展及血管并发症发展的共享分子特征。
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加权蛋白共表达网络分析（WGCNA）：选择软阈值β=6，动态树切割后合并得到五个模块。棕色和蓝绿色模块与疾病组关联最强，159种蛋白符合枢纽标准。与DAP重叠后确定38种候选蛋白（4种上调，34种下调），呈现从Pro-NC经Pro-DM到Pro-DA的一致性表达轨迹。
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功能富集分析：GO分析富集的生物学过程包括过氧化氢代谢、氧化剂解毒及SRP依赖性共翻译蛋白靶向膜；KEGG分析涉及核糖体、胰高血糖素信号、碳代谢及N-糖基化通路；GSEA进一步揭示卵母细胞减数分裂、剪接体、细胞周期、三羧酸循环及丙酮酸代谢的富集。
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蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析：38种特征蛋白映射至STRING v11.0，去除3个孤立节点后形成35种蛋白的网络（平均度14.86，聚类系数0.40）。通过MCC和DMNC两种算法共同优先排序的候选枢纽蛋白为ADSL、LGALS3、MGAT1和VSIG4。在Pro-DA vs Pro-NC中，ADSL下调，LGALS3、MGAT1和VSIG4上调。
临床验证阶段：
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基线特征比较：Pat-DA组年龄显著大于Pat-NC和Pat-DM组（P<0.001），病程显著更长（P<0.001）。收缩压以Pat-DA组最高。空腹血糖和HbA1c在Pat-DM和Pat-DA组均显著高于Pat-NC组。甘油三酯在Pat-DM组最高，HDL-C呈逐渐下降趋势。TyG指数在三组间差异显著。
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候选蛋白表达水平变化：ELISA结果与蛋白质组学发现一致。ADSL表达随疾病进展下降，MGAT1、LGALS3和VSIG4升高，以Pat-DA组最高。
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候选蛋白与临床指标的相关性：Spearman相关分析显示，血清ADSL水平随血糖控制恶化（病程、FBG、HbA1c）而降低，而MGAT1、LGALS3和VSIG4升高。FDR校正后，ADSL、MGAT1、LGALS3和VSIG4与年龄和病程保持显著相关；MGAT1和VSIG4还与收缩压、HbA1c及多项血脂参数显著相关；LGALS3主要与年龄和病程相关。
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多变量逻辑回归分析：Firth惩罚逻辑回归（校正年龄、病程和HbA1c）显示，ADSL每增加1个标准差与流行性大血管并发症风险降低相关（OR=0.327，P=0.0199），MGAT1每增加1个标准差与风险升高相关（OR=7.435，P=2.71×10–6）。LGALS3（OR=1.490，P=0.1223）和VSIG4（OR=1.232，P=0.2509）呈正相关但未达统计学显著性。
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四蛋白组合的诊断区分能力及增量价值：单个蛋白AUC分别为ADSL 0.805、MGAT1 0.912、LGALS3 0.736、VSIG4 0.686。四蛋白组合模型AUC为0.961。临床模型（年龄+病程+HbA1c）AUC为0.835，加入四蛋白组合后AUC提升至0.973（ΔAUC=0.138，P=0.008）。分类NRI为0.314，IDI为0.261。组合模型校准良好（Brier评分=0.032）。五折分层交叉验证（重复50次）显示组合模型平均CV-AUC为0.972±0.033（乐观度=0.001）。
动物实验：
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一般情况：Mod-DM和Mod-DA组呈现高血糖、体重增加及血脂紊乱。Mod-DA组体重、血糖及血脂水平显著高于Mod-NC和Mod-DM组。Mod-DM和Mod-DA组的TyG指数及血清IL-6、IL-1β、TNF-α显著高于Mod-NC组。
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主动脉病理学改变：油红O染色显示Mod-DA组斑块/管腔比显著升高。HE染色显示Mod-NC血管正常，Mod-DM内膜增厚伴泡沫细胞，Mod-DA管腔严重受损伴复杂斑块。
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目标蛋白在主动脉组织中的定位与表达：免疫组化显示ADSL在Mod-NC丰富，Mod-DM减少，Mod-DA稀疏；而LGALS3、MGAT1和VSIG4在Mod-DA斑块和血管壁中强表达。
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RT-qPCR验证：ADSL mRNA在三个组中逐渐下降，MGAT1、LGALS3和VSIG4 mRNA在两组糖尿病组中显著上调，以Mod-DA最高。
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Western blot验证：ADSL在Mod-DA最低，LGALS3、MGAT1和VSIG4在Mod-DA最高，与临床血清数据和蛋白质组学发现一致。
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目标蛋白表达与血清标志物的相关性：ADSL与TC、TG、LDL-C及三种细胞因子负相关，与HDL-C正相关。MGAT1与LDL-C及细胞因子相关。LGALS3和VSIG4与TC、TG、LDL-C及细胞因子同向变化，与HDL-C反向变化。FDR校正后，ADSL、LGALS3和VSIG4与所有七项生化指标保持显著相关；MGAT1与LDL-C、HDL-C、IL-6和TNF-α保持显著相关。
讨论与结论
本研究通过血浆蛋白质组学筛选、独立临床队列验证及动物模型支持，确定了四种候选蛋白。ADSL表达随临床分组进展而下降，而MGAT1、LGALS3和VSIG4表达升高。四蛋白组合模型优于任何单一标志物（AUC=0.961），与每种蛋白反映不同病理过程（ADSL代表代谢、MGAT1代表糖基化、LGALS3代表炎症、VSIG4代表免疫调节）的观点一致。在Firth惩罚回归模型中，ADSL和MGAT1与流行性大血管疾病独立相关。研究人员推测LGALS3和VSIG4在多变量模型中的衰减可能反映累积的代谢和炎症负荷而非缺乏生物学相关性，动物模型中两者的一致上调支持该假说。组合模型较单独临床模型显著改善诊断性能，校准良好且内部验证稳定。研究结论：ADSL和MGAT1与流行性大血管并发症独立相关。LGALS3和VSIG4可能反映累积的代谢和炎症负荷而非缺乏生物学相关性；动物研究为该假说提供了支持性证据。四蛋白组合在临床变量基础上改善了诊断区分能力。这些发现基于小型发现队列及内部验证，具有探索性；因此这四种蛋白最佳被视为与流行疾病相关的候选诊断生物标志物。有必要进行前瞻性外部验证。
