《Frontiers in Food Science and Technology》：Production and characterization of antidiabetic peptides from kefir-fermented goat milk with anti-inflammatory activity: an in silico, in vitro and molecular docking interactions
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引言：开菲尔（kefir）发酵可能促进羊乳蛋白的蛋白水解，并生成具有可测定体外生物活性的含肽组分。本研究考察了发酵过程中蛋白水解及消化酶抑制作用的变化，对含肽组分进行了表征，并在体外巨噬细胞模型中评价了发酵羊乳的细胞应答。方法：采用开菲尔发酵剂发酵羊乳，评估蛋
引言：开菲尔（kefir）发酵可能促进羊乳蛋白的蛋白水解，并生成具有可测定体外生物活性的含肽组分。本研究考察了发酵过程中蛋白水解及消化酶抑制作用的变化，对含肽组分进行了表征，并在体外巨噬细胞模型中评价了发酵羊乳的细胞应答。方法：采用开菲尔发酵剂发酵羊乳，评估蛋白水解程度及对α-淀粉酶（α-amylase）、α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）和胰脂肪酶（pancreatic lipase）的体外抑制活性，并比较不同发酵剂浓度与时间点的发酵条件。采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和动态光散射（DLS）表征光谱特征与粒径分布。在RAW 264.7巨噬细胞中评价细胞毒性和炎症应答。含肽组分通过超滤、反相高效液相色谱（RP-HPLC）、电泳和反相液相色谱-质谱联用（RP-LC/MS）进行表征。候选肽经计算机模拟筛选，并选取SCQDQPTTLAR进行探索性分子对接。结果与讨论：发酵48 h后，对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的抑制率分别达到68.87%、70.21%和61.40%，蛋白水解活性增至5.523 mg/mL。以4.8–6.8 mg开菲尔发酵剂/100 mL乳发酵48 h为最优条件，蛋白水解活性达5.93 mg/mL。FTIR和DLS显示发酵相关的结构变化。发酵羊乳（GMK）对RAW 264.7细胞无细胞毒性，在1 mg/mL时降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）和活性氧（ROS）水平。3 kDa透过液表现出最强的α-葡萄糖苷酶抑制作用（75.20%），而10 kDa截留液蛋白水解活性最高（6.35 mg/mL）。RP-LC/MS鉴定出乳源肽，对接分析表明SCQDQPTTLAR与人胆汁盐激活脂肪酶（hBAL）、人麦芽糖酶-葡糖淀粉酶（hMGA）和人胰α-淀粉酶（hPAM）存在相互作用，涉及His435和Asp300。BIOPEP-UWM、PeptideRanker及毒性预测进一步支持所鉴定肽的潜在生物活性与安全性。结论：开菲尔发酵与蛋白水解增强及可测定的体外消化酶抑制作用相关。超滤产生了抑制活性各异的组分，发酵羊乳改变了RAW 264.7细胞中部分炎症及ROS相关指标。上述发现支持对开菲尔发酵羊乳及其含肽组分作为潜在功能食品配料开展进一步研究，其临床抗糖尿病疗效或产品货架期仍需进一步研究予以确立。
研究背景：全球非牛乳产量每年约1.33亿吨，占世界乳总产量的17%以上，其中羊乳约占非牛乳产量的13.5%。羊乳除鲜食外还用于多种乳制品加工，但家庭自用及小规模生产部分常未纳入官方统计，实际产量可能更高。羊乳产量受繁殖性能、饲料供应和气候条件影响而呈季节性波动，其理化特性与组成受品种、泌乳阶段、饲喂方式、牧场管理和环境条件等多因素影响。羊乳蛋白谱与脂肪特性的差异可能影响其营养与加工特性，其较小脂肪球和特征性脂肪酸组成被认为与消化和营养利用有关；但研究人员强调不应据此认为羊乳普遍优于牛乳，其潜在的低致敏性仍属学术讨论而非既定特性，尤其对牛乳蛋白过敏人群不应视为普遍低致敏。羊乳含肽类、共轭亚油酸（CLA）和寡糖等潜在生物活性成分，是开发功能性发酵乳制品的良好原料。羊乳富含酪蛋白、乳清蛋白、免疫球蛋白和乳铁蛋白，其蛋白及衍生肽显示抗氧化、抗炎、抗高血压、免疫调节和抗糖尿病等作用。糖尿病（DM）为广泛流行的代谢性疾病，其中2型糖尿病（T2DM）约占90%，其全球负担加重促使人们关注膳食策略、功能食品和天然活性物作为血糖管理的补充手段。生物活性肽因可影响糖代谢而备受关注，尤其是通过抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV（DPP-IV）以及可能影响肠促胰岛素相关通路。选择羊乳作为底物的依据是其蛋白组成与牛乳不同，特别是αS1-酪蛋白等酪蛋白组分相对丰度差异可能影响蛋白消化性、水解及后续肽释放。已有研究显示羊乳蛋白水解物具有抗氧化活性及对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的显著抑制作用，计算机模拟研究也发现多种羊乳源肽可与α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、AMPK和DPP-IV相互作用。开菲尔粒相关微生物（主要为乳酸菌和酵母）可发酵羊乳生成开菲尔，微生物蛋白酶作用于乳蛋白使其降解为小肽和游离氨基酸；已有研究表明开菲尔发酵与贮藏可增强蛋白水解并增加生物活性肽生成，开菲尔复杂肽组成包含1500余种源于乳蛋白的天然序列。本研究旨在考察开菲尔发酵羊乳过程中生成肽的潜在代谢相关性，同时指出糖尿病为涉及GLP-1介导的肠促胰岛素信号、SGLT2介导的肾脏葡萄糖处理、PPARγ相关代谢调节、胰岛素敏感性及肝脏葡萄糖稳态等多通路的多因素疾病，故评价食源肽需考虑消化酶抑制之外的作用；本研究聚焦肽生成、体外消化酶抑制和抗炎应答，其他糖稳态通路的作用有待进一步研究。
研究方法与结论：研究人员以开菲尔发酵羊乳，优化发酵以促进肽生成，并评价其对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的体外抑制活性；对优化条件下富肽组分用蛋白质组学和光谱学方法表征，并在脂多糖（LPS）刺激的RAW 264.7巨噬细胞中评价其潜在抗炎作用。结果显示发酵48 h后三种酶抑制率分别达68.87%、70.21%和61.40%，蛋白水解活性增至5.523 mg/mL；4.8–6.8 mg/100 mL发酵48 h为最优条件，蛋白水解活性5.93 mg/mL。FTIR和DLS显示发酵相关结构变化；GMK无细胞毒性并在1 mg/mL降低TNF-α、IL-6、IL-1β和ROS。3 kDa透过液α-葡萄糖苷酶抑制最强（75.20%），10 kDa截留液蛋白水解活性最高（6.35 mg/mL）。RP-LC/MS鉴定出乳源肽，对接显示SCQDQPTTLAR与hBAL、hMGA和hPAM相互作用，涉及His435和Asp300；BIOPEP-UWM、PeptideRanker和毒性预测支持其潜在活性与安全性。研究意义在于支持开菲尔发酵羊乳及其含肽组分作为潜在功能食品配料进一步研究，但临床抗糖尿病疗效或产品货架期仍需后续研究确立。
关键技术方法（不超过250字）：羊乳（Surati品种，产自印度古吉拉特邦，采自Kamdhenu大学兽医学院畜牧场）经90 °C加热10–15 min后接种开菲尔发酵剂（FD-DVS eXact? KEFIR 1，含乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌丁二酮变种、明串珠菌属、嗜热链球菌和汉逊德巴利酵母）于37 °C发酵；采用α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶体外抑制试验及邻苯二甲醛（OPA）法测定蛋白水解活性；通过超滤（3和10 kDa）、RP-HPLC、SDS-PAGE、二维凝胶电泳（2D-PAGE）和RP-LC/MS鉴定肽；以MTT法、DCFDA-流式细胞术和酶联免疫吸附试验（ELISA）评价RAW 264.7细胞毒性、ROS及细胞因子；采用DLS和衰减全反射FTIR（ATR-FTIR）表征；运用BIOPEP、PeptideRanker、PEPstrMOD、PrankWeb和HADDOCK 2.4进行计算机模拟与分子对接，数据以双因素完全随机设计（CRD）及方差分析（ANOVA）结合Tukey检验分析。
研究结果：3.1 消化酶（α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和脂肪酶）抑制试验：随发酵时间延长抑制活性呈上升趋势，0 h时三者抑制率分别为7.01%、5.17%和2.95%，48 h后增至68.87%、70.22%和61.40%；作者指出该增强可能与微生物蛋白水解及肽或其他发酵衍生组分生成有关，但现有结果不能证明仅由肽负责，因未设单独发酵剂对照，无法区分发酵剂、发酵衍生化合物与发酵乳基质各自贡献。3.2 蛋白水解评价：接种4.8 mg/100 mL时蛋白水解活性由0 h的3.24±0.12 mg/mL升至48 h的5.56±0.07 mg/mL，5.8和6.8 mg/100 mL呈相似时间依赖模式，6.8 mg/100 mL发酵48 h活性最高（5.93±0.08 mg/mL）；发酵剂浓度与时间均显著影响（P<0.05），交互作用不显著；48 h仅为实验条件下的发酵终点而非货架期，体外抑制增强不等于生理或治疗效应增强。3.3 超滤组分的RP-HPLC分析：优化条件（6.8 mg/100 mL，37 °C，48 h）下经3和10 kDa超滤后RP-HPLC分离，发酵乳色谱信号数与峰强度均增加提示广泛水解；<3 kDa透过液检出肽峰最多（57个，保留时间7.637–46.703 min），>10 kDa截留液、>3 kDa截留液和<10 kDa透过液分别为52、51和51个峰；3 kDa透过液对α-淀粉酶（74.07%）、α-葡萄糖苷酶（75.20%）和胰脂肪酶（68.69%）抑制均最强，提示超滤可有效富集<3 kDa组分中的活性肽。3.4 SDS-PAGE评价：发酵后10–70 kDa区带强度显著降低，3和10 kDa截留液保留15–80 kDa条带而透过液条带微弱或无，说明发酵有效降解蛋白且超滤可按分子大小分离肽。3.5 二维凝胶电泳：pH 3–10 IPG胶条结合SDS-PAGE共检出42个分辨良好的蛋白点，多数位于10–100 kDa，15–40 kDa间可见多个显著点，高分子量点较少，提示天然乳蛋白被开菲尔微生物蛋白水解广泛水解。3.6 RP-LC/MS鉴定与结构表征：凝胶点经胰蛋白酶消化后行RP-LC/MS，质谱经Mascot检索Swiss-Prot并以BIOPEP筛选潜在抗糖尿病序列，据毒性和PeptideRanker值筛选候选肽；SCQDQPTTLAR排名最高（0.74，非毒性），与QP、DQ、QD、TL、TT等已报道片段匹配，TPEVDKEALEK、VYVEELKPTPEGDLEILLQK和FVYAPFPEVFR亦与多个已知抗糖尿病片段对应；但本研究未确证各肽的母体羊乳蛋白，也未与牛乳同源肽作直接序列比较，上述对应仅为数据库关联而非羊乳与牛乳源肽差异的证据。3.7 抗炎活性：MTT法显示0.25–5 mg/mL范围内细胞活力为对照的101.03%–113.45%，无显著下降（P>0.05），据此选1 mg/mL进一步评价；LPS刺激使ROS升至约40.5%，GMK显著降至21.3%（P<0.0001），较LPS组降低近47%；TNF-α由1109.45 pg/mL降至487.22 pg/mL（P<0.0001，抑制56%）；IL-6由1912.13 pg/mL降至1025.28 pg/mL、IL-1β由460.83 pg/mL降至241.67 pg/mL（P<0.0001），表明GMK可同时抑制氧化应激和多种炎症介质。3.8 粒径分布：Z-average由未发酵羊乳145.8 nm增至发酵后166.3 nm，10 kDa透过液最大（510.2 nm），3 kDa透过液236.3 nm，3和10 kDa截留液分别为175.2和160.6 nm；DLS仅反映流体动力学粒径分布，不能直接证明蛋白构象变化或将颗粒鉴定为肽聚集体。3.9 FTIR：3200–3500 cm?1区含O–H和N–H伸缩贡献，1600–1700 cm?1区含蛋白相关酰胺I带，酰胺I带位于约1637.45 cm?1，谱带轮廓和强度差异提示发酵与分级后蛋白相关官能团化学环境改变，但FTIR单独不能证明特定二级结构转变或直接确认肽形成。3.10 候选肽分子对接：SCQDQPTTLAR因肽排名得分较高被优先用于探索性对接；对hBAL（PDB ID: 1F6W）、hPAM（3BAI）和hMGA（3CTT）的HADDOCK得分分别为?79.0±1.0、?74.4±0.9和?71.5±1.7；与hBAL的Arg63、Met111、Tyr125、Pro273、Leu274、His435和Asp437相互作用，其中His435为hBAL催化三联体（Ser194–Asp320–His435）组分；与hMGA的Thr205、Trp406、Met444和His602相互作用；与hPAM的Trp58、Ala106、Tyr151、Asp300和His305相互作用，其中Asp300与Asp197、Glu233同为胰α-淀粉酶催化重要残基，提示可能干扰催化位点。
讨论与结论：作者将本研究结果与既往研究比较：与Nehir El等（2015）报道开菲尔发酵羊乳及其消化肽组分具有明显α-淀粉酶抑制活性（IC50分别为139±12、27±5和32±7 μg蛋白/mL）一致，但该研究在所用浓度范围内未检出α-葡萄糖苷酶抑制，本研究则显示延长开菲尔发酵显著改善羊乳抗糖尿病活性，可能与乳蛋白渐进性水解及生物活性肽持续生成有关。与Hashemi和Gholamhosseinpour（2020）关于植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）发酵羊乳α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制随时间显著增加（24 h最强）的结果一致，并支持微生物蛋白水解的作用。蛋白水解结果与Panchal等（2022）关于瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）MTCC 5463发酵羊乳的研究可比，其在2.0%接种量下活性由1.54 mg/mL升至48 h的8.59 mg/mL。RP-HPLC结果与Parmar等（2020）经3和10 kDa超滤分离发酵羊乳肽组分的结果一致；SDS-PAGE结果与Panchal等（2022）及Nehir El等（2015）报道的发酵后完整蛋白条带减弱、低分子量肽增多一致；2D-PAGE结果与Panchal等（2020）检出39个蛋白点（10–51 kDa）可比，本研究检出42个点。抗炎结果与Han等（2026）关于藏灵菇发酵水牛乳在LPS刺激RAW 264.7细胞中降低NO、TNF-α、IL-6和ROS的报道一致，亦与Dell'Orco等（2026）关于开菲尔发酵乳无细胞毒性并降低IL-6和IL-17A的观察一致。结构与Pipaliya等（2024）关于植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）KGL3A发酵羊乳经粒径、FTIR等分析显示构象改变及超滤按分子大小分离肽的结果一致；FTIR结果与Padhiyar等（2026）关于乳酸菌和酵母发酵骆驼乳酰胺I带（1637 cm?1）增强的结果一致；对接结果与该研究报告骆驼乳源肽CCFSSCAMR与hBAL的Arg63和hPAM的His305相互作用模式可比，但作者强调对接仅提示预测的分子相互作用，其实际贡献需实验证实。结论（译文）：开菲尔发酵有效促进了羊乳中具有潜在抗糖尿病和抗炎活性生物活性肽的生成；优化发酵过程增强了蛋白水解并提高了对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的抑制作用；超滤所得各组分中<3 kDa组分抗糖尿病活性最强，光谱和蛋白质组学分析表明发酵过程中发生了广泛的蛋白水解和肽形成；RP-LC/MS鉴定出多种源于羊乳蛋白的肽，其潜在生物活性与安全性得到计算机模拟分析的支持；分子对接进一步表明所选肽SCQDQPTTLAR通过有利的分子相互作用与消化酶hBAL、hPAM和hMGA结合，支持其在酶抑制中的潜在作用；此外，开菲尔发酵羊乳与LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞具有良好的生物相容性，并能降低氧化应激和促炎细胞因子的产生。综上，上述发现表明开菲尔发酵羊乳是具有代谢健康功能食品和营养保健品应用潜力的生物活性肽来源，但其治疗功效尚需进一步的体内和临床研究予以确立。
