《Frontiers in Molecular Biosciences》：Exploratory analysis of cell-free miRNA expression changes in patients with isolated first seizure and new-onset epilepsy
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十分之一的人一生中会经历一次癫痫发作，但仅43%–61%会被诊断为新发癫痫（new-onset epilepsy, NOE）。现有区分首次非诱发性发作与癫痫诊断的方法不足，常导致不必要的抗癫痫发作药物（antiseizure medications, ASM）
十分之一的人一生中会经历一次癫痫发作，但仅43%–61%会被诊断为新发癫痫（new-onset epilepsy, NOE）。现有区分首次非诱发性发作与癫痫诊断的方法不足，常导致不必要的抗癫痫发作药物（antiseizure medications, ASM）治疗。为揭示与新发癫痫（NOE）相关的潜在靶点，研究人员分析了20例以首次非诱发性发作（first unprovoked seizure, FUS）就诊患者血浆样本中的无细胞循环微小RNA（cell-free circulating miRNA）表达。患者在首次发作后接受2年监测，随访期内共7例患者发生第二次发作。miRNA表达水平分析显示，仅经历一次首次非诱发性发作的患者与发生第二次发作的患者之间存在15个差异表达miRNA。这15个miRNA在实验证据中被关联为160个癫痫相关基因的调控因子，包括参与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和WNT信号通路的基因。这些发现突出了一系列关键循环miRNA靶点，可能进一步在更大队列中开发为生物标志物特征，并可能为癫痫发生（epileptogenesis）相关因素提供见解。
研究背景与目的：十分之一的人一生中会经历一次癫痫发作，而首次非诱发性发作（first unprovoked seizure, FUS）后2年内复发风险为43%–61%，达到新发癫痫（new-onset epilepsy, NOE）诊断标准。现有预测FUS后是否进展为NOE的方法包括临床病史、神经系统检查、脑电图（electroencephalography, EEG）和神经影像等，但预测能力有限：磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）仅在新发发作患者中约23%显示潜在致癫痫病灶，EEG约50%异常，且判读存在偏倚和评分者间可靠性差，约25%病例被误诊，8%癫痫患者常规30 min EEG无发作间期癫痫样放电；延长EEG成本高且不便。约40%符合国际抗癫痫联盟治疗标准的FUS患者不会再发，存在过度治疗和抗癫痫发作药物（antiseizure medications, ASM）不必要负担。分子诊断是有前景的策略；癫痫发生（epileptogenesis）假说涉及表观遗传、非编码RNA等调控，既往脑组织研究显示甲基化、基因表达、miRNA表达、蛋白表达及翻译后修饰与癫痫发生相关，部分分析物可在外周血检测。因此，研究人员分析FUS后是否进展为NOE患者的无细胞（cell-free, CF）miRNA变化，以寻找潜在生物标志物。
方法概述：该研究为前瞻性、双中心观察性研究，样本来自2018年9月9日至2024年12月2日期间在Providence Saint Vincent Medical Center或Providence Portland Medical Center就诊的FUS患者队列；纳入≥18岁、经癫痫专家评估的FUS患者，排除既往多次发作、首次发作至评估>60天、正在使用ASM及急性症状性首次发作；20例患者采血并分离血浆，?80C保存且不超过1次冻融；采用NanoString nCounter Human v3 miRNA Panel检测CF miRNA，RefFinder选择稳定参考miRNA归一化，NanoStringDiff进行差异表达分析（q≤0.05），mirPathDB 2.0、DAVID、clusterProfiler和StringDB进行靶基因及通路富集分析。
结果：
3.1 差异miRNA表达分析：20例患者中7例在2年内发生第二次发作并符合NOE，13例为孤立性首次发作（isolated first seizure, IFS）。经RefFinder归一化后，NanoStringDiff分析发现15个miRNA在ISF与NOE患者间表达差异显著（q<0.05），其中13个在NOE患者中表达升高，2个表达降低。
3.2 差异miRNA靶基因数据库分析：研究人员用mirPathDB 2.0仅纳入文献中实验验证的相互作用，鉴定出2253个独特靶基因；结合既往癫痫相关基因数据库中的974个基因，得到160个被差异miRNA靶向的癫痫相关独特基因。
3.3 差异miRNA靶基因生物学通路分析：KEGG和DAVID富集分析显示66条KEGG通路，多数富集通路为病毒来源；与癫痫研究相关的通路包括Wnt和mTOR信号通路。StringDB网络显示AKT3、BRAF、PIK3R2、TBL1XR1四个既往与癫痫相关基因参与这些通路。
讨论总结：研究优势在于参与者由癫痫专家筛查且均未服用ASM，可避免ASM对miRNA表达的影响。差异miRNA中，hsa-mir-579-3p在NOE患者中升高，既往被显示为帕金森病易感性标志，而癫痫患者帕金森病风险更高，作者认为该升高与上述观点相符；hsa-mir-122-5p在NOE中降低，既往显示具有神经保护作用。差异miRNA调控超过2200个基因，DAVID富集到mTOR等与癫痫发生相关通路；mTOR通路上调与神经元高兴奋性、神经炎症和细胞死亡相关，与凋亡通路富集一致，mTOR抑制剂被视为潜在治疗选择；Wnt信号通路与神经元兴奋性相关，可能成为治疗靶点。既往与癫痫相关的mir-134和mir-132在本研究差异miRNA列表中未出现；作者解释多数miRNA生物标志物研究来自动物模型或确诊颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy, TLE）患者的脑组织，ASM使用和较长病程可影响miRNA表达，而本研究为近期首次发作、未治疗、无既往发作史患者，仅7例最终诊断NOE，TLE较少，样本量不足以检测不同癫痫病因间的表达差异。该研究为20例发现性试点，需在更大队列验证；样本量限制统计效能和受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线等稳定判别分析。局限包括样本量小、无健康对照、循环miRNA可能受年龄、性别、种族和民族、用药、合并症及采血时间影响，双中心和小样本限制混杂因素校正；未来应纳入正常对照并进行纵向采血。
研究结论翻译：总之，研究人员识别出可区分表现为孤立性首次发作（IFS）的患者与进展为新发癫痫（NOE）的患者的独特循环miRNA特征。这些发现进一步提供证据表明外周miRNA谱可能反映与癫痫发生相关的生物学过程。然而，鉴于样本量小且缺乏健康对照，所识别的miRNA应被视为候选生物标志物而非临床可操作标志物。需要在更大队列、前瞻性、多中心研究中验证，以确认其可重复性、确定其诊断和预后效用，并确立其在临床决策中的潜在作用。
