三阴性乳腺癌中TRIM33启动子低甲基化与表达上调的关联研究

《Frontiers in Oncology》：Promoter hypomethylation associated with elevated TRIM33 expression in triple-negative breast cancer patients

摘要专业翻译 引言： 三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）是一种高度侵袭性且异质性强的乳腺癌亚型，治疗选择有限，预后较差，主要归因于复发、转移及治疗耐药。含三结构域蛋白家族（tripartite motif-containing protein family, TRIM）成员因在细胞增殖、侵袭、迁移和转移中的功能，已成为肿瘤生长的重要调控因子。TRIM33已被证实在多种癌症中根据背景不同发挥肿瘤抑制或肿瘤促进作用，部分归因于其参与TGF-β相关信号通路。然而，关于TRIM33在TNBC中的表达模式及表观遗传调控知之甚少，尤其是在印度患者中。 方法： 研究纳入28例经组织学确诊的TNBC患者。手术时收集肿瘤组织及配对癌旁非肿瘤乳腺组织。采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）、蛋白质印迹法（western blotting）和免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）评估TRIM33 mRNA和蛋白表达水平。采用甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR, MS-PCR）评估TRIM33启动子甲基化状态。 结果： 与配对癌旁非肿瘤组织相比，TNBC组织中TRIM33表达升高。28例中19例（67.9%）观察到TRIM33 mRNA表达升高，28例中16例（57.1%）检测到TRIM33蛋白表达升高。28例中22例（78.6%）观察到TRIM33启动子呈未甲基化/低甲基化模式。TRIM33蛋白表达与部分临床病理特征（包括临床分期）显著相关。启动子甲基化状态亦与部分临床病理参数相关。 结论： TRIM33启动子低甲基化在TNBC中频繁出现，并与TRIM33表达升高及部分临床病理特征相关。这些发现提示TRIM33的表观遗传调控可能在TNBC中发挥潜在作用，并需在更大规模患者队列中验证。

论文解读

一、研究背景与科学问题

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）以雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕激素受体（progesterone receptor, PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）均为阴性为特征，是一种高度侵袭性、分子异质性强的乳腺癌亚型。TNBC转移潜能高、靶向治疗选择有限，主要治疗手段为化疗，但耐药问题突出，患者总体生存率显著降低。TNBC的分子异质性导致肿瘤进展、转移潜能、预后及治疗反应存在显著的肿瘤间和肿瘤内差异。因此，识别表观遗传调控的分子改变，包括与基因表达改变相关的异常启动子甲基化，有助于界定生物学上不同的TNBC亚群，并促进分子分层研究。

含三结构域蛋白（tripartite motif-containing protein, TRIM）家族蛋白及泛素E3连接酶活性在自噬、先天免疫、凋亡和细胞生长等多种细胞功能中发挥关键作用。TRIM33，又称转录中间因子1γ（transcriptional intermediary factor 1 gamma, TIF1γ），编码一种参与TGF-β/Smad信号传导、转录调控和细胞分化的多功能蛋白。TRIM33在癌症中的角色具有高度背景依赖性，不同恶性肿瘤中既有促肿瘤也有抑肿瘤功能的报道。例如，TRIM33在结直肠癌中高表达并与肿瘤分期相关，且与SMAD4缺失相关及不良临床结局有关；而在肝细胞癌中，TRIM33表达降低与肿瘤进展和不良临床结局相关。然而，TRIM33在TNBC中的表达模式及其表观遗传调控机制此前尚未被充分阐明。基于此，研究人员开展了本研究，旨在评估TNBC中TRIM33在mRNA和蛋白水平的表达，分析其与临床病理特征的关联，并进一步探讨TRIM33启动子甲基化状态与其表达改变之间的可能关系。

二、研究设计与主要结论

本研究纳入28例经组织学确诊的TNBC女性患者，手术时收集肿瘤组织及配对癌旁非肿瘤乳腺组织，样本来源于印度比哈尔邦巴特那英迪拉·甘地医学科学研究所国家癌症研究所。研究经该机构伦理委员会批准，所有参与者签署书面知情同意书。研究得出以下主要结论：TNBC组织中TRIM33表达较配对癌旁非肿瘤组织升高；TRIM33启动子低甲基化在TNBC中频繁出现，并与TRIM33表达升高及部分临床病理特征相关。这些发现提示TRIM33的表观遗传调控可能在TNBC的分子生物学中发挥作用，为后续更大规模前瞻性研究提供了基础。

三、关键技术方法

研究人员采用了以下几项关键技术方法。样本来源于印度比哈尔邦巴特那英迪拉·甘地医学科学研究所国家癌症研究所收治的28例TNBC患者。采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）以GAPDH为内参基因、以配对癌旁组织为校准器，通过2^?ΔΔCt法评估TRIM33 mRNA相对表达量。采用蛋白质印迹法（western blotting）检测TRIM33蛋白表达水平并以GAPDH为内参进行灰度分析。采用免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）对石蜡包埋组织切片进行TRIM33蛋白表达的半定量评估，按阳性染色细胞百分比分为无表达、轻度、中度和高表达。采用甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR, MS-PCR）对亚硫酸氢盐转化后的基因组DNA进行TRIM33启动子甲基化状态检测，甲基化特异性引物扩增产物为170 bp，未甲基化特异性引物扩增产物为171 bp。

四、研究结果

纳入患者的临床特征： 研究纳入28例TNBC女性患者，平均年龄48.7±11.2岁。12例（42.9%）为绝经前，16例（57.1%）为绝经后。22例（78.6%）处于晚期临床分期（III–IV期），6例（21.4%）为I–II期。

TNBC患者中TRIM33表达上调： qRT-PCR分析显示，TNBC组织中TRIM33 mRNA表达较配对癌旁非肿瘤乳腺组织升高。28例中19例（67.9%）观察到TRIM33 mRNA表达升高，3例（10.7%）表达降低，6例（21.4%）无明显变化。配对t检验显示肿瘤组织与癌旁组织间TRIM33 mRNA表达差异具有统计学意义（P=0.0045）。TRIM33 mRNA表达与年龄（≤50岁组高于>50岁组，P=0.032）和肿瘤大小（≤5 cm组高于>5 cm组，P=0.004）显著相关。

TRIM33蛋白表达及其与临床病理特征的关联： 蛋白质印迹法和免疫组织化学分析显示，28例中16例（57.1%）TRIM33蛋白表达升高，肿瘤组织中TRIM33蛋白表达总体高于配对癌旁组织。TRIM33蛋白高表达与年龄≤50岁（P=0.023）、绝经前状态（P=0.023）及晚期临床分期（III–IV期，P=0.002）显著相关，其中III–IV期患者中16例高表达、6例低表达，而I–II期患者中无一例高表达。

过表达病例中的启动子低甲基化： MS-PCR分析显示，28例中22例（78.6%）TRIM33启动子呈未甲基化/低甲基化模式，3例（10.7%）呈甲基化模式，3例（10.7%）为未改变状态。未甲基化/低甲基化模式在TRIM33表达升高的病例中频繁出现。启动子甲基化状态与绝经状态（P=0.002）和临床分期（P<0.001）显著相关，III–IV期患者中22例全部呈未甲基化/低甲基化模式，而I–II期患者中3例甲基化、3例未改变、无一例未甲基化/低甲基化。

五、讨论与结论

讨论部分指出，TRIM33在癌症中的作用具有背景依赖性。本研究观察到TRIM33表达升高与晚期临床分期相关，提示TRIM33失调可能与TNBC疾病进展有关，但研究为横断面设计且未包含纵向生存分析，不应将此关联解读为预后效应的直接证据。mRNA水平（67.9%）与蛋白水平（57.1%）升高比例的差异可能反映转录后和翻译后调控机制，包括mRNA稳定性、翻译效率、蛋白稳定性及降解的差异。TRIM33启动子低甲基化在78.6%的病例中频繁出现且与TRIM33表达升高并存，提示启动子甲基化状态与TRIM33调控之间可能存在关联，但MS-PCR仅提供甲基化状态的定性评估，不能定量检测特定CpG位点的甲基化水平，因此该关联尚不能确立因果关系。研究局限性包括样本量较小、横断面设计、MS-PCR的定性性质，未来需在更大独立队列中采用焦磷酸测序或靶向亚硫酸氢盐测序等定量方法，并结合功能验证和长期临床随访加以确认。

研究结论： 本研究证实在相当比例的TNBC病例中TRIM33在mRNA和蛋白水平均表达升高，同时频繁观察到TRIM33启动子呈未甲基化/低甲基化模式，提示启动子甲基化状态与TRIM33表达改变之间可能存在关联。此外，TRIM33表达和启动子甲基化状态与部分临床病理特征（尤其是临床分期）相关。这些发现提示TRIM33的表观遗传调控可能在TNBC的分子生物学中发挥作用。然而，鉴于研究样本量相对较小且为横断面设计，这些发现应谨慎解读，需在更大患者队列中通过定量甲基化分析、功能验证和临床随访进一步阐明TRIM33失调在TNBC中的生物学及潜在临床意义。