靶向树突状细胞的重组多表位疫苗CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)抗细粒棘球蚴感染的免疫学特性与保护效力研究

《Frontiers in Immunology》：Immunological characterization of a multi-epitope vaccine against Echinococcus granulosus based on the extracellular structural domain of CTLA-4

　　

目的：本研究旨在探究重组抗原CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)的免疫学特性和免疫效力，为开发有效预防细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus）的多表位疫苗（multi-epitope vaccine）提供依据。方法：研究人员从NCBI检索目标抗原序列；应用IEDB和SYFPEITHI预测CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)表位，并通过ProtParam、ProtScale、DNASTAR和SWISS-MODEL分析理化性质与三级结构。研究人员构建重组质粒，使其在大肠埃希菌（Escherichia coli）BL21(DE3)中表达，经镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化，并以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）确认。将小鼠树突状细胞（dendritic cells，DCs）与重组蛋白共培养24 h，用流式细胞术（flow cytometry）分析成熟和抗原结合。研究人员用重组蛋白和佐剂免疫Balb/c小鼠；用流式细胞术评估DC成熟，用Cell Counting Kit-8（CCK-8）评估脾细胞增殖，用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）和免疫球蛋白G（IgG）。免疫小鼠用细粒棘球蚴攻击感染；120天后计算囊湿重抑制率，分析脾DC成熟、Th1/Th2（辅助性T细胞1/2）谱和血清细胞因子。结果：获得CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)氨基酸序列，表位分析显示6个T细胞和B细胞共同相关表位，CTLA-4胞外区或GSGGSG连接序列未引起表位位移。生物信息学工具成功预测其理化性质与空间结构。重组质粒构建并在BL21细胞中表达；纯化蛋白经His抗体确认，并与囊型棘球蚴病（CE）感染血清显示特异性Western blotting反应性。CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)在体外和体内促进DC成熟，增强脾细胞增殖，升高IFN-γ、IL-4和IgG水平。在攻击实验中，该组显示较低感染率和囊湿重，较高Th1和较低Th2反应，具有有利的IFN-γ/IL-4谱。结论：本研究证实CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)是一种具有显著免疫原性和抗原性的多表位疫苗，为囊型棘球蚴病（cystic echinococcosis，CE）的管理和治疗提供了不可或缺的理论和实证基础。

研究背景与问题：人棘球蚴病由棘球属绦虫引起，主要形式为囊型棘球蚴病（cystic echinococcosis，CE）和泡型棘球蚴病（alveolar echinococcosis，AE）。CE由以细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus）为中心的种复合体感染所致，人通过摄入污染食物、水、土壤中的虫卵或直接接触动物宿主感染。现有血清学方法检测针对细粒棘球蚴抗原的特异性抗体，但所用抗原易与其他绦虫甚至吸虫抗体交叉反应，早期诊断方法不足。该病传播隐匿、病程长，早中期常无症状，出现症状多已晚期，治疗复杂，需广泛手术和长期药物；手术联合阿苯达唑或甲苯达唑虽有较好临床疗效，但存在术中传播、术后复发、药物生物利用度低、副作用和耐药等风险。CE潜伏期5–20年，>60%有症状者已为晚期囊肿（CE2/CE3b），对药物和手术反应差，并发症相关死亡率2%–5%。全球每年>18,000新发CE，约184,000伤残调整生命年（DALYs），高流行区近20年疾病负担未显著下降；现有干预不能消除环境虫卵污染或阻断犬-家畜-人传播循环。世界卫生组织（WHO）2021–2030年被忽视热带病路线图将棘球蚴病疫苗开发列为优先，有效预防性疫苗可在源头阻断六钩蚴/原头蚴在中宿主机肝肺建立，降低原发感染。本研究疫苗策略为上游预防补充而非替代治疗，通过人工免疫使宿主产生特异性免疫，切断传播链，保护高危人群，减少未来药物或手术病例。寄生虫病防控逐渐转向免疫预防，表位疫苗具高特异性、安全性好、设计灵活、可同时诱导体液和细胞免疫等优势。EgG1Y162抗原具强免疫原性，前期预测其T/B细胞表位，EgG1Y162-2含更多表位，用GSGGSG连接四拷贝形成EgG1Y162-2(4)可增强免疫原性；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）胞外域保留B7（CD80/CD86）结合基序“MYPPPY”，可靶向抗原呈递细胞（APCs），pET30a(+)骨架来源的“GTDDDDKAMADIGSEF”连接序列可分隔CTLA-4IgV与EgG1Y162-2(4)，避免空间位阻，故CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)为理想候选。

研究人员采用生物信息学预测该重组蛋白的理化性质、空间结构及T/B细胞表位，并开展免疫学实验验证。结果显示该蛋白具良好抗原性，可促进DC成熟和脾细胞增殖，升高IFN-γ、IL-4和IgG，攻击感染后降低感染率和囊湿重并纠正Th2偏移。结论为CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)是具有显著免疫原性和抗原性的多表位疫苗，为CE管理和治疗提供理论与实证基础；其意义在于为抗细粒棘球蚴多表位疫苗开发提供依据。

关键技术方法：研究人员从NCBI获取序列，用IEDB和SYFPEITHI预测T/B细胞表位，用ProtParam、ProtScale、DNASTAR和SWISS-MODEL分析理化性质及二、三级结构；构建pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组质粒，在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达，经Ni-NTA亲和层析纯化，以SDS-PAGE和Western blotting鉴定；用小鼠骨髓来源DC共培养及流式细胞术检测DC成熟与结合；免疫Balb/c小鼠后以流式、CCK-8和ELISA评价DC成熟、脾细胞增殖及IFN-γ、IL-4、IgG；以细粒棘球蚴原头蚴（protoscoleces）腹腔攻击感染，120天后评估感染率、囊湿重抑制率、脾Th1/Th2及血清细胞因子。C57小鼠来自新疆医科大学实验动物中心；细粒棘球蚴原头蚴分离自中国新疆乌鲁木齐米东区当地牛羊屠宰场感染细粒棘球蚴羊肝。

研究结果：
3.1.1 蛋白氨基酸序列：通过NCBI获取EgG1Y162登录号BAH30229.1，EgG1Y162-2为52–120氨基酸、全长69个氨基酸，并给出CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)序列，得出目标序列。
3.1.2 优势T细胞和B细胞表位预测：通过IEDB和SYFPEITHI预测，结合两库筛出潜在优势T/B联合表位52–62、119–133、197–207、272–282、347–357、422–432，CTLA-4胞外区和GSGGSG连接未导致表位位移。
3.1.3 理化性质：通过ProtParam显示该蛋白由435个氨基酸组成，相对分子质量47,318.22，理论等电点（PI）5.67，不稳定指数24.54，GRAVY为?0.264；ProtScale显示第126位氨基酸评分最低（?2.589），第175、250、325、400位最高（1.300），得出理化参数预测结果。
3.1.4 空间结构：通过DNASTAR预测二级结构、SWISS-MODEL同源建模三级结构，序列一致性75%，GMQE为0.34，Ramachandran图评价模型，得出所构建空间结构模型可靠。
3.2.1 pET30a-CTLA4-IgV-EgG1Y162-2(4)质粒酶切鉴定：通过单酶和双酶切琼脂糖凝胶电泳，单酶切出现线性带，双酶切约5,354和1,312 bp片段，符合预期。
3.2.2 CTLA4-IgV-EgG1Y162-2(4)蛋白原核表达与纯化：通过SDS-PAGE在53 kDa见目标带，Ni-NTA亲和层析纯化，His抗体识别53 kDa目标带，得出成功表达并纯化蛋白。
3.2.3 Western blotting检测免疫反应性：通过感染小鼠和感染患者血清在约53 kDa出现目标带、正常小鼠和健康人无目标带，间接提示感染后可产生CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)特异性抗体，疫苗设计具良好免疫原性和免疫反应性。
3.2.4 DC抗原捕获能力和成熟：通过骨髓来源DC与两种蛋白共培养24 h及流式检测，CTLA-4组MHC-II⁺DC为17%±1.217%，高于EgG1Y162-2(4)组12.27%±0.379%（F=59.85，p<0.01），二者均促DC分化，CTLA-4组更明显。
3.2.5 免疫小鼠DC成熟：通过免疫后脾DC流式检测，CTLA-4组CD11c⁺细胞MHC-II和CD86表达率为27.58%±1.378%和22.33%±0.997%，高于EgG1Y162-2(4)组23.85%±0.887%和19.50%±0.732%（p<0.05），表明CTLA-4IgV提高DC成熟率。
3.2.6 CCK-8评估脾淋巴细胞增殖：通过CCK-8检测，CTLA-4组脾细胞增殖能力强于EgG1Y162-2(4)组及正常、阴性对照组，表明可促进淋巴细胞增殖并诱导免疫应答。
3.2.7 ELISA定量IL-4和IFN-γ：通过免疫6周脾细胞ELISA检测，CTLA-4组IL-4和IFN-γ分泌水平高于EgG1Y162-2(4)组及对照，表明可诱导更强细胞免疫应答。
3.2.8 预防性干预后特异性保护抗体IgG评估：通过ELISA检测，疫苗组产生IgG，EgG1Y162-2(4)效价1:1,350，CTLA-4组效价1:4,050，表明CTLA-4组诱导更高抗体滴度。
3.2.9 攻击感染小鼠肝和棘球蚴囊大体病理变化：通过感染后120天解剖观察，Eg模型组腹腔见游离囊肿、肝表面见5–10 mm乳白囊肿，对照组无囊肿且肝光滑；重组蛋白组囊肿数和肝表面负担减少，CTLA-4组仅少量<5 mm囊肿，肝大小颜色接近正常。
3.2.10 攻击感染小鼠感染率和囊湿重抑制率：通过统计感染率和囊湿重，模型组感染率100%，CTLA-4组降至16.7%；各疫苗组囊湿重显著低于模型组（p<0.001），CTLA-4组囊湿重抑制率93.97%±14.78%，表明引入CTLA-4IgV进一步增强抑制寄生虫发育能力。
3.2.11 攻击感染小鼠脾细胞Th1和Th2细胞亚群百分比：通过流式检测CD4⁺IL-4⁺（Th2）和CD4⁺IFN-γ⁺（Th1），模型组Th2为3.34%±1.10%升高、Th1为2.57%±0.54%降低；CTLA-4组Th2最低2.04%±0.40%、Th1最高4.13%±0.72%，显著高于模型组和EgG1Y162组，表明可逆转Th2偏倚并诱导更强Th1型细胞免疫。
3.2.12 攻击感染小鼠血清IFN-γ和IL-4分泌水平：通过ELISA检测，模型组IFN-γ为3.16±0.83 pg/mL降低、IL-4为28.78±4.88 pg/mL升高；CTLA-4组IFN-γ最高9.74±2.35 pg/mL、IL-4最低10.12±4.26 pg/mL，表明疫苗组可逆转Th2偏倚。

讨论部分总结：讨论围绕CE危害、现有手术和药物治疗局限、疫苗阻断传播的必要性、EgG1Y162/EmY162研究基础、多表位疫苗与CTLA-4IgV靶向DC的设计依据展开；指出细粒棘球蚴长期寄生和免疫逃逸使生物信息学疫苗设计复杂，单亚单位蛋白疫苗难以诱导高水平保护，故采用富含T/B联合表位的EgG1Y162-2(4)并经GSGGSG串联，以CTLA-4IgV靶向APC。研究通过表位预测、DC成熟、脾淋巴细胞增殖、细胞因子和IgG检测及攻击感染实验验证免疫保护，并发现疫苗可纠正Eg感染所致Th2偏倚。讨论还指出局限：结构为同源建模预测，未做X射线晶体学或冷冻电镜验证；血清量不足未做IgG亚类分析；未精确定量残余内毒素；因动物房空间和弗氏完全佐剂（CFA）单独注射致溃疡疼痛的伦理福利问题未设佐剂单独对照；体内攻击样本量有限（n=6），囊湿重抑制率需谨慎解释。未来需在自然宿主验证、评估长期记忆免疫、采用更安全佐剂、探索口服/鼻黏膜免疫及分泌型IgA、开展体外稳定性试验。研究结论翻译：本研究证实CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)是一种具有显著免疫原性和抗原性的多表位疫苗，为囊型棘球蚴病（CE）的管理和治疗提供了不可或缺的理论与实证基础。