ATG/PTCy方案下异基因造血干细胞移植后T细胞多功能性免疫重建特征及其与GvHD和CMV再激活的关联

《Frontiers in Immunology》：T-cell polyfunctionality reconstitution after modified anti-thymocyte globulin plus post-transplant cyclophosphamide in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation

　　

目的：抗胸腺细胞球蛋白（anti-thymocyte globulin，ATG）联合移植后环磷酰胺（post-transplant cyclophosphamide，PTCy）（ATG/PTCy）方案越来越多地用于移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GvHD）预防；然而，该方案后的功能性免疫重建仍缺乏充分表征。基于绝对细胞计数的常规免疫监测可能不能充分反映免疫能力。方法：研究人员回顾性分析了76例接受异基因外周血干细胞移植后ATG/PTCy方案（ATG 2.5 mg/kg/天于第?2天和第?1天；环磷酰胺50 mg/kg于第+3天）的患者。收集第+30、+60、+90、+180和+360天的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），以葡萄球菌肠毒素B（Staphylococcal enterotoxin B，SEB）刺激，并采用COMPASS衍生的功能评分（functionality score，FS）和多功 能评分（polyfunctionality score，PFS）评估T细胞功能。评估免疫重建与急性GvHD（acute GvHD，aGvHD）、慢性GvHD（chronic GvHD，cGvHD）、病毒再激活和血流感染之间的关联。结果：移植后180天内，34.2%的患者发生aGvHD，包括25.0%为Grade II–IV aGvHD，61.8%发生巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）再激活。峰值CMV DNA载量>500 IU/mL与aGvHD发生率更高、EB病毒（Epstein–Barr virus，EBV）DNA检出、多重病毒感染和菌血症相关。90天内，Grade II–IV aGvHD患者CD4⁺和CD8⁺ FS和PFS低于无Grade II–IV aGvHD患者。较高CMV DNA水平与第+90天和第+180天T细胞功能受损相关。第+60天，CD8⁺ T细胞功能观察到aGvHD与CMV再激活交互作用的趋势。第+180天，较高CD8⁺ T细胞计数和功能活性与cGvHD发生几率增加相关，而较高CD4⁺ T细胞和B细胞水平与较低发生几率相关。至第+360天，较高B细胞比例仍与cGvHD呈反向关联，而CD4⁺ T细胞水平无显著关联。结论：功能免疫监测可能补充免疫细胞计数，并有助于接受ATG/PTCy为基础的异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）患者的个体化移植后风险评估。

研究背景：异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）仍是高危血液恶性肿瘤的治愈性手段，但移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GvHD）是其主要障碍，导致显著并发症、生活质量受损和移植相关死亡增加。抗胸腺细胞球蛋白（anti-thymocyte globulin，ATG）和移植后环磷酰胺（post-transplant cyclophosphamide，PTCy）是常用GvHD预防策略；在以外周血干细胞（peripheral blood stem cell，PBSC）为移植物时，单用PTCy与较高GvHD累积发生率相关，剂量调整ATG联合PTCy（ATG/PTCy）可降低GvHD并改善生存，但该方案后免疫重建数据仍少，且多数研究聚焦定量免疫恢复，对免疫功能能力评估不足。常规绝对细胞计数未必充分反映免疫能力，因此研究人员开展本研究以刻画ATG/PTCy预防下PBSC移植后T细胞功能性免疫重建动力学，并探索其与移植相关并发症的关联。研究纳入76例接受ATG/PTCy方案的患者，主要为单倍体供者（haploidentical donor，HID）65例和HLA相合无关供者（HLA-matched unrelated donor，MUD）11例，并设12例年龄和性别匹配健康供者作为T细胞功能对照；结论提示功能免疫监测可补充免疫细胞计数，有助于个体化移植后风险评估。

关键技术方法概括：本研究为回顾性队列分析，样本来源于接受ATG/PTCy方案后异基因PBSC移植的76例患者，其中HID 65例、MUD 11例，并纳入12例年龄和性别匹配健康供者作为对照。研究人员在第+30、+60、+90、+180和+360天采集PBMC，以SEB刺激后经流式细胞术检测白细胞介素（interleukin，IL）-2、干扰素（interferon，IFN）-γ、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和巨噬细胞炎性蛋白（macrophage inflammatory protein，MIP）-1β，采用COMPASS计算CD4⁺和CD8⁺ T细胞FS与PFS；同时用TBNK试剂检测主要淋巴细胞亚群，记录GvHD、病毒再激活和血流感染，并采用logistic回归、线性混合效应模型、Kaplan-Meier法、Gray检验及Bonferroni校正进行统计分析。

研究结果：患者特征和临床结局方面，移植后180天内34.2%发生aGvHD，其中25.0%为Grade II–IV aGvHD；61.8%发生CMV再激活，EBV DNA检出率23.6%，100天内血流感染25.0%；2年内21.1%发生中重度cGvHD，累积复发率（cumulative incidence of relapse，CIR）21.2%，无事件生存（event-free survival，EFS）率76.0%。按Grade II–IV aGvHD分为Cohort A和Cohort B，两组基线总体平衡；Cohort A中性粒细胞植入更快，CMV峰值DNA载量更高。以500 IU/mL为界，高载量组aGvHD及Grade II–IV aGvHD发生率更高，EBV DNA检出、多重病毒感染和菌血症更多，来特莫韦（letermovir，LMV）预防比例更低；多因素分析显示Grade II–IV aGvHD与CMV再激活风险相关，峰值CMV DNA载量与Grade II–IV aGvHD风险相关。

ATG/PTCy方案HSCT患者的免疫重建方面，CD3⁺ T细胞和B细胞比例及绝对计数逐渐恢复，自然杀伤（natural killer，NK）细胞恢复最早；CD8⁺ T细胞恢复快于CD4⁺ T细胞，CD4⁺/CD8⁺比值倒置常见。SEB反应性CD4⁺和CD8⁺ T细胞被分为15个功能亚群，随时间由单功能向多功能转变；CD4⁺ T细胞功能恢复延迟，第+180天超过半数患者低或无反应，至1年接近健康对照；CD8⁺ T细胞功能前90天改善后趋稳，第+180天仍低于健康对照，第+360天16.0%仍低或无反应。线性混合效应模型显示9项免疫参数均有显著时间效应；Cohort B的CD19⁺ B细胞、CD4⁺ FS/PFS、CD8⁺ FS/PFS较高，CD4⁺ FS/PFS存在显著时间×组交互。白细胞和淋巴细胞计数与T细胞功能呈中度正相关，但校正移植后天数后不再显著，提示主要反映共同时间趋势。

aGvHD和CMV再激活与功能性T细胞免疫重建延迟相关方面，Grade II–IV aGvHD未显著影响T细胞计数恢复，但前90天CD4⁺和CD8⁺ FS/PFS显著较低；第+30天CD4⁺功能无显著差异，第+60天和第+90天B细胞水平较低，第+180天和第+360天两组T细胞功能趋同。CMV高载量组可见T细胞扩增，尤其CD8⁺ T细胞，但第+90天和第+180天T细胞功能显著低于低载量组，1年时恢复至相近水平；第+60天CD8⁺ T细胞功能可见aGvHD与CMV再激活交互作用趋势。

T细胞功能与cGvHD的关联方面，第+180天单因素分析显示较高CD8⁺ T细胞比例及功能活性与中重度cGvHD风险增加相关，较高CD4⁺ T细胞和B细胞水平与风险降低相关；多因素分析大体证实，但CD8⁺ PFS未达统计学显著。第+360天较高CD8⁺ T细胞比例与cGvHD发生几率增加相关，较高CD19⁺ B细胞比例与发生几率降低相关；CD4⁺ T细胞比例或功能评分无显著关联。Grade II–IV aGvHD与cGvHD风险增加相关，早期菌血症与cGvHD风险降低相关。

讨论部分总结：ATG/PTCy可降低GvHD且不损害单倍体PBSC移植获益，但该联合免疫抑制策略下免疫重建数据有限。研究结果支持aGvHD与CMV再激活相互促进的风险关系；常规血细胞计数不能完全捕捉功能性免疫重建，直接功能监测具有潜在价值。SEB刺激联合多细胞因子检测和COMPASS分析较单一IFN-γ指标更全面反映T细胞功能质量；本队列表现为CD8⁺ T细胞功能早期恢复、CD4⁺ T细胞功能延迟恢复，aGvHD和CMV再激活均与功能性T细胞恢复延迟相关，cGvHD则与CD8⁺ T细胞活化及B细胞恢复相关。与单用PTCy或ATG“北京方案”及匹配同胞供者移植相比，ATG/PTCy可能早期免疫抑制更明显，尤其CD4⁺ T细胞功能受损，但一年时功能恢复未见持续损害；研究局限性包括回顾性设计、样本量较小、Grade II–IV aGvHD和中重度cGvHD事件数有限，不能进行因果推断，多因素分析可能过拟合，且非复发死亡、总生存和CIR事件少，无法可靠开展纳入时间依赖免疫参数的多变量生存分析，logistic回归未考虑事件发生时间和竞争风险，需更大样本前瞻性多中心研究及Cox回归和竞争风险模型验证。研究结论翻译：功能免疫监测可能补充免疫细胞计数，并有助于接受ATG/PTCy为基础的allo-HSCT患者的个体化移植后风险评估。