咖啡酸经MAPKs/CREB轴抑制炎症介导的巨噬细胞-成纤维细胞串扰减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌纤维化

《Chinese Medicine》：Caffeic acid mitigates myocardial fibrosis via suppressing MAPKs/CREB-mediated inflammation in myocardial ischemia–reperfusion injury mice

　　

背景：心肌缺血–再灌注损伤（MIRI）是再灌注治疗过程中继发性损伤的主要形式，其中炎症和心肌纤维化是关键病理特征。咖啡酸（CA）是一种膳食来源丰富的天然酚类化合物，已被认为具有心血管保护作用；然而，CA调控MIRI后炎症和纤维化的机制仍未充分明确。目的：阐明CA减轻MIRI后炎症相关心肌纤维化的分子靶点和信号机制。方法：采用基于左前降支冠状动脉（LAD）结扎的小鼠MIRI模型评估CA的抗炎和抗纤维化疗效。应用心脏成纤维细胞与RAW 264.7巨噬细胞共培养体系以及过继细胞转移，探究巨噬细胞–成纤维细胞串扰。进行转录组分析（RNA-seq）以识别CA介导保护作用涉及的候选通路。采用表面等离子共振（SPR）实验、细胞热位移分析（CETSA）、免疫荧光和蛋白质印迹评估MAPKs/CREB信号作为假定干预轴，并采用MAPKs药理学激活剂（anisomycin）或CREB激活剂（forskolin），或MAPK14消融，以探究通路参与情况。结果：CA改善MIRI小鼠心脏功能并减轻炎症和纤维化病理，伴随促炎细胞因子抑制。LPS刺激的RAW 264.7细胞条件培养基促进成纤维细胞活化，心肌内过继转移的巨噬细胞促进纤维化蛋白表达；CA均减弱上述效应。RNA-seq提示MAPK信号参与CA保护机制，下游分析支持抑制MAPKs/CREB轴。值得注意的是，CA达到与MAPK14消融相当的效果，而anisomycin或forskolin部分削弱CA的抗炎和抗纤维化作用，符合MAPKs/CREB信号在MIRI期间CA介导保护中的功能性参与。结论：CA通过抑制MAPKs/CREB介导的炎症信号减轻MIRI相关心肌纤维化，支持其改善MIRI后长期重塑的潜力。

研究背景：再灌注是挽救缺血心肌的必要手段，但血流突然恢复可加重组织损伤，即心肌缺血–再灌注损伤（MIRI）。MIRI病理生理涉及氧化损伤、钙超载、炎症和不可逆细胞死亡通路，可导致心功能障碍、心律失常和心力衰竭；接受经皮冠状动脉介入治疗的患者中约30%–50%出现临床相关再灌注损伤，而有效减轻策略有限。MIRI的核心致病机制之一是由损伤相关分子模式（DAMPs）启动的无菌性炎症，损伤心肌细胞释放内源性危险信号，激活模式识别受体并触发炎症级联；中性粒细胞和巨噬细胞随后浸润受损心肌，持续促炎反应促进不良心脏重塑。炎症细胞浸润还可提供纤维化刺激，驱动病理性细胞外基质（ECM）沉积。心肌纤维化是多种心血管疾病的共同病理标志，成纤维细胞活化是其主要驱动因素；MIRI早期成纤维细胞分泌胶原以修复组织并维持心脏结构，但过度胶原沉积增加心肌僵硬度、损害收缩力并促进适应不良性重塑。丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun N端激酶（JNK）和p38 MAPK，是炎症信号中枢；p38 MAPK激活可通过诱导TNF-α和IL-6、促进成纤维细胞分化及刺激肌成纤维细胞促纤维化信号参与心脏病理。CREB是直接调控炎症细胞因子产生和纤维化ECM沉积相关基因的转录因子；p38 MAPK激活可增强下游CREB信号，p38 MAPK/CREB轴已在多种心血管疾病模型中与心脏纤维化、炎症和病理性重塑相关，抑制该轴与心脏炎症、纤维化和功能障碍改善相关。CA是存在于苹果、蓝莓和苹果酒等膳食来源的天然酚酸，具有抗氧化、抗菌和抗炎等多种生物活性；体外研究提示CA通过调节核因子κB（NF-κB）和MAPK信号减少促炎介质表达，从而减轻LPS诱导的炎症损伤。然而，MIRI后MAPKs/CREB信号参与炎症级联和心肌纤维化的系统证据仍少，CA在该情境中的作用尚未被探索。因此，研究人员探讨CA是否减轻MIRI后炎症相关心肌纤维化并阐明潜在机制。

研究人员开展了什么研究、得出什么结论及意义：研究人员采用LAD结扎建立小鼠MIRI模型，给予CA 12.5、25或50 mg/kg/day灌胃，并以吡非尼酮300 mg/kg/day作为阳性对照，评估心脏功能、心肌肥大、炎症和纤维化；建立RAW 264.7巨噬细胞与小鼠心脏成纤维细胞（MCFs）条件培养基（CM）共培养体系，并进行心肌内过继细胞转移以探究巨噬细胞–成纤维细胞串扰；通过RNA-seq筛选候选通路，结合分子对接、SPR、CETSA、免疫荧光和蛋白质印迹评估MAPKs/CREB轴，并使用MAPKs激活剂anisomycin、CREB激活剂forskolin及心肌细胞特异性MAPK14^Δ/Δ小鼠进行通路验证。研究结论为CA改善MIRI小鼠心脏功能、减轻病理性肥大和心肌纤维化，并抑制炎症微环境，其抗炎和抗纤维化作用至少部分通过抑制MAPKs/CREB信号实现。该研究支持CA作为限制MIRI后不良纤维化重塑的潜在治疗候选物，并为炎症–纤维化耦合机制提供依据。

关键技术方法（不超过250字）：研究使用雄性C57BL/6小鼠（购自湖北BlONT），MAPK14^flox/flox小鼠与Myh6-Cre转基因小鼠来自华中农业大学，经杂交获得心肌细胞特异性MAPK14^Δ/Δ小鼠；RAW 264.7巨噬细胞和小鼠心脏成纤维细胞为商品化细胞系。关键技术包括LAD结扎MIRI模型、超声心动图、H&E与Masson染色、WGA染色、免疫荧光、流式细胞术、条件培养基共培养、Transwell迁移、划痕愈合和EdU增殖实验、心肌内过继细胞转移、RNA-seq与生物信息学分析、分子对接、SPR、CETSA、蛋白质印迹、ELISA和RT-qPCR，以及anisomycin/forskolin药理学干预和MAPK14缺失验证。

研究结果：
1. 咖啡酸改善MIRI小鼠心脏纤维化和功能障碍：超声心动图显示MIRI降低左心室射血分数（LVEF）和左心室缩短分数（LVFS），高剂量CA改善二者；WGA染色显示MIRI心肌细胞增大，中、高剂量CA和吡非尼酮减轻肥大；大体观察和HW/TL比值显示CA减轻心脏扩大；Masson染色显示CA减少胶原沉积和纤维化面积；蛋白质印迹显示CA降低α-SMA和胶原III水平，效果与吡非尼酮相当。
2. 咖啡酸抑制MIRI后心脏炎症：H&E染色显示MIRI心肌坏死、结构紊乱和炎性细胞浸润，中、高剂量CA剂量依赖性减轻；CA降低心脏TNF-α和IL-1β mRNA；流式细胞术显示CA减少F4/80⁺巨噬细胞频率并减弱Ly6C⁺促炎表型增加；免疫共染色显示CA降低M1（CD86⁺）/M2（CD206⁺）巨噬细胞比例；RAW 264.7细胞中CA降低IL-6、TNF-α和iNOS mRNA并升高Arg1。
3. 咖啡酸抑制炎症介导的心脏成纤维细胞活化：CD86与α-SMA免疫荧光在MIRI边缘区高表达，CA降低其表达；LPS刺激RAW 264.7来源CM促进MCFs增殖（PCNA、CCND1及EdU）和迁移（Transwell、划痕），CA抑制这些效应；心肌内过继转移BMDM促进α-SMA和胶原III表达，CA显著抑制；TGF-β1直接刺激成纤维细胞时，CA未显著抑制MAPKs/CREB活化，也未降低α-SMA或胶原III，提示在该实验条件下无炎症细胞时CA不直接抑制成纤维细胞活化。
4. 咖啡酸通过MAPK通路减轻巨噬细胞诱导的炎症和心肌纤维化：RNA-seq的PCA和差异基因分析显示CA处理组转录组部分趋近对照，KEGG富集提示CA下调适应性免疫反应、ECM组织和MAPK级联调控等通路；MIRI心肌p38 MAPK、JNK和ERK磷酸化升高，CA降低其磷酸化，尤其p38 MAPK和JNK；分子对接预测CA与MAPK关键残基SER-293和SER-251形成氢键；SPR显示CA与p38 MAPK14剂量依赖性结合，KD为7.37 μM；CETSA显示CA处理降低p38 MAPK14热降解；CA降低LPS诱导的IL-6、TNF-α和IL-1β分泌，anisomycin逆转；anisomycin逆转CA对MCF迁移的抑制；心肌细胞特异性MAPK14缺失与CA在心脏功能、纤维化和巨噬细胞极化方面保护作用相当。
5. 咖啡酸通过MAPKs/CREB通路在体外抑制炎症和心脏成纤维细胞活性：MIRI心肌p-CREB升高，CA逆转；RAW 264.7中LPS诱导p-CREB信号，CA抑制；forskolin逆转CA对p-CREB的抑制，但不逆转CA对p-p38 MAPK的抑制；CA降低LPS诱导的IL-6、IL-1β、TNF-α和iNOS并升高Arg1，forskolin减弱CA抗炎作用；CA降低MCF迁移和增殖，forskolin增强这些活动。
6. 咖啡酸通过MAPKs/CREB信号通路改善MIRI小鼠心肌纤维化：体内anisomycin减弱CA对p-p38 MAPK和p-CREB的抑制；forskolin逆转CA对p-CREB的抑制，但不显著逆转对p-p38 MAPK的抑制；anisomycin和forskolin均减弱CA对LVEF和LVFS的保护、逆转CA降低血清IL-6、IL-1β和TNF-α的作用，并削弱CA改善组织病理学的作用；Masson染色显示CA减轻心肌纤维化，而anisomycin或forskolin共处理加重纤维化重塑。

讨论总结与结论翻译：讨论指出，CA是广泛存在于咖啡、茶、红酒、水果和草药等人类饮食中的天然多酚，具有抗炎、抗氧化和抗菌活性；CA及其类似物在心血管情境中已有保护报道，包括高血糖诱导的内皮功能障碍、高血压、心肌梗死和MIRI，且CA可在多种组织器官模型中减轻纤维化进展。本研究在小鼠MIRI模型中验证CA疗效，观察到改善心脏功能、减轻肥大和减少心肌纤维化的综合心脏保护作用；研究关注未修饰CA，因为其天然形式更直接相关于膳食暴露和早期干预，且成纤维细胞活化可在体外数小时至数天内建模，而心肌纤维化需更长体内时程体现，实验设计涵盖体外活化表型和体内已形成纤维化。MIRI诱导的失调纤维化过程中，免疫细胞浸润和炎症细胞因子作用关键；促炎介质促进M1巨噬细胞极化，形成放大炎症和心肌损伤的正反馈，而抗炎信号支持M2极化和保护性反馈。本研究中CA减少心肌炎症浸润、降低IL-1β和TNF-α、降低巨噬细胞丰度并减少M1极化；RAW 264.7中CA抑制IL-6、TNF-α和iNOS mRNA并促进Arg1，支持巨噬细胞介导的抗炎作用；CD86与α-SMA共免疫染色及心肌内巨噬细胞过继转移证实M1巨噬细胞与后续心肌纤维化的联系，并显示CA抑制该病理过程。MIRI微环境中免疫细胞浸润可通过促纤维化细胞因子触发成纤维细胞过度活化和增殖，驱动ECM沉积和胶原分泌，最终导致不良重塑和收缩功能障碍；成纤维细胞与巨噬细胞存在动态双向串扰，炎症巨噬细胞亚群可驱动成纤维细胞活化、肌成纤维细胞分化和TGF-β依赖的促纤维化通路。本研究共培养体系显示炎症巨噬细胞来源信号促进成纤维细胞增殖和迁移，CA抑制该致病性相互作用。RNA-seq显示MIRI上调而CA下调的基因富集于MAPK信号级联；MAPKs包括ERK、JNK和p38 MAPK是炎症信号中心调节因子，其激活参与炎症基因表达、心脏纤维化和肥大；JNK和p38 MAPK调节炎症、凋亡和纤维化并促进TNF-α、IL-1β和IL-6表达，从而不利影响心脏功能；MAPK依赖的巨噬细胞极化也可通过细胞间串扰加重心脏损伤。本研究中CA降低MAPK级联磷酸化，尤其p38 MAPK和JNK；整合分子对接、SPR和CETSA获得支持CA与p38 MAPK直接结合的证据；anisomycin减弱CA对炎症和心脏成纤维细胞迁移的抑制；在MIRI模型中，CA达到与心肌细胞特异性MAPK14缺失相当的心脏保护效果，支持MAPK抑制可能是CA改善MIRI相关病理的主要机制。p38 MAPK激活可进一步增强下游CREB活性，促进心脏炎症和重塑；CREB是调控增殖、分化、存活和适应性反应的核转录因子，磷酸化CREB为其活性形式，Ser133磷酸化受多种激酶情境依赖调控；CREB活化与炎症反应相关，包括通过MAPKs/CREB信号。本研究中MIRI后磷酸化CREB升高，CA降低，提示MIRI中CREB激活及CA有效抑制；CREB药理学激活减弱CA对炎症介质、成纤维细胞活性、心脏功能和病理组织改变的调节作用，支持CREB参与CA治疗机制；CREB激活不逆转CA对MAPK磷酸化的抑制，而MAPK激活可抵消对CREB的抑制，符合MAPKs/CREB信号级联。研究局限包括其他机制可能参与CA调控MIRI后纤维化重塑，需进一步研究；使用细胞系而非原代细胞可能不能完全再现体内病理微环境；虽然体外实验确认CA对成纤维细胞无显著直接抑制作用，但体内MAPKs/CREB通路验证依赖药理学调节而无组织或细胞类型特异性靶向，因此巨噬细胞和成纤维细胞对体内效应的相对贡献仍待确定，未来需细胞类型特异性方法明确其在体内的因果作用。结论翻译：在本研究中，天然多酚咖啡酸（CA）给药在小鼠MIRI模型中减轻MIRI诱导的心脏功能障碍、病理性肥大和心肌纤维化。对炎症微环境的调节有助于这些心脏保护作用，表现为巨噬细胞浸润减少和促炎介质抑制。机制上，CA的抗炎和抗纤维化作用至少部分通过抑制MAPKs/CREB信号介导。总之，这些发现支持CA作为限制MIRI后不良纤维化重塑的潜在治疗候选物。