《Veterinary Research》：Strain and cell type dependent induction of tunnelling nanotube-like projections by African swine fever virus
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非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是一种毁灭性猪病毒病，死亡率可高达100%。其病原体非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）优先靶向单核吞噬细胞系统（mononuclear phagocytic
非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是一种毁灭性猪病毒病，死亡率可高达100%。其病原体非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）优先靶向单核吞噬细胞系统（mononuclear phagocytic system, MPS）细胞。尽管该病造成严重的经济和动物健康影响，欧洲仍缺乏有效的抗病毒治疗。研究人员此前已证明，ASFV Belgium 2018/01株可诱导单核源巨噬细胞（monocyte-derived macrophages, MDMs）形成隧道纳米管（tunnelling nanotube, TNT）样突起，使远距离细胞之间建立物理连接。本文中，研究人员探讨了这一现象在猪髓系细胞群和ASFV毒株中的更广泛相关性。研究人员评估了ASFV感染后单核细胞、肺肺泡巨噬细胞（pulmonary alveolar macrophages, PAMs）、脾巨噬细胞、极化与非极化MDMs及Vero细胞中TNT样突起的形成，并进一步比较了代表不同基因型和毒力水平的20株ASFV。值得注意的是，管腔单核细胞和PAMs未形成ASFV诱导的突起，而单核细胞向MDMs分化过程中突起形成增加。脾巨噬细胞也形成突起，提示间质组织巨噬细胞获得诱导突起的能力。与非极化MDMs相比，极化MDMs表现出 reduced 的突起形成。Ba71V感染的Vero细胞中可诱导类似结构，为机制研究提供标准化模型。重要的是，全部20株ASFV均在MDMs中诱导TNT样突起，尽管程度差异显著，且与病毒基因型或毒力无关。这些发现表明，ASFV诱导的TNT样突起形成是跨不同ASFV毒株保守的、细胞状态依赖性表型。这些发现为鉴定TNT形成的细胞与病毒决定因素，并界定其在ASFV传播和致病机制中的潜在贡献提供了基础。
研究背景与问题：非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是家猪和野猪的高致死性出血性疾病，死亡率可达100%，由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起；ASFV主要感染单核吞噬细胞系统（mononuclear phagocytic system, MPS）细胞，尤其偏好组织巨噬细胞，但其与宿主细胞互作复杂，欧洲尚无有效抗病毒治疗，安全有效疫苗开发亦受制约。ASFV为大型包膜胞质DNA病毒，基因组编码约170–190种蛋白，基于B646L基因编码的主要衣壳蛋白p72 C端序列可分为23个基因型（I–XXIII）。组织巨噬细胞具有高度异质性，肺肺泡巨噬细胞（pulmonary alveolar macrophages, PAMs）位于肺泡腔，间质巨噬细胞位于结缔组织；炎症或感染时，循环单核细胞募集至组织并分化为单核源巨噬细胞（monocyte-derived macrophages, MDMs），后者可极化为促炎MDM1或抗炎MDM2。研究人员此前发现ASFV Belgium 2018/01（BE18）株可在MDMs中诱导隧道纳米管（tunnelling nanotubes, TNT）样突起，连接远距离细胞；但不同MPS亚群及不同ASFV毒株是否均能诱导该表型尚缺乏系统数据。为此，研究人员比较不同猪髓系细胞群及20株ASFV诱导TNT样突起的能力，以明确其细胞状态依赖性和毒株保守性，并为ASFV传播与致病机制研究提供基础。
主要技术方法：研究人员采用猪外周血来源单核细胞，经人巨噬细胞集落刺激因子（human macrophage colony-stimulating factor, hM-CSF）分化为MDMs，并以LPS（lipopolysaccharide）/IFN-γ（interferon-γ）或IL-4（interleukin-4）诱导MDM1/MDM2；同时分离肺来源PAMs和脾来源巨噬细胞，并设Vero细胞模型。ASFV面板含19株田间分离株和Vero适应株Ba71V，代表14种基因型及不同毒力；BE18分离自2018年比利时Etalle死亡野猪脾，部分毒株由Carmina Gallardo（EURL-ASF, CISA-INIA）和Carrie Batten（WOAH参考实验室, Pirbright）提供。感染后以荧光显微镜定量p72阳性细胞及含直、丝状肌动蛋白（filamentous actin, F-actin）阳性突起的细胞；实时定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）检测p72与β-actin；一步生长曲线比较BE18和MFUE 6/1；采用ANOVA和t检验。
研究结果：
1 ASFV感染诱导MDMs和脾巨噬细胞而非PAMs形成TNT样突起。研究人员比较PAMs、脾巨噬细胞和MDMs，在BE18感染18 hpi（感染复数MOI=1）下，PAMs感染率5.89%±3.69%，脾巨噬细胞31.15%±3.38%，MDMs 37.20%±2.63%；p72阳性MDMs中突起细胞为42±4.58/600，显著高于脾巨噬细胞18.67±3.77/600，而PAMs无突起；mock感染各组突起细胞极少。结论：巨噬细胞组织来源影响ASFV诱导的突起形成。
2 TNT样突起数量随单核向MDMs成熟而增加。研究人员在2、24、48、72 h培养阶段监测CD14/CD163表达、细胞面积、感染率及突起。2 h单核感染率仅4.18%±2.406且无突起；24 h出现14.33±6.429/600 p72阳性突起细胞，48 h升至30.67±1.528/600，72 h达42.00±4.583/600；感染率48 h达53.83%±10.81后稳定。结论：单核向MDMs成熟过程中逐步获得并增强突起形成能力。
3 极化巨噬细胞TNT样突起数量减少。研究人员比较未极化MDMs、MDM1和MDM2，MDMs感染率42.77%±3.227，高于MDM1的27.93%±6.324（显著）和MDM2的36.97%±4.891；突起细胞在MDMs为31.33±8.327/600，约为MDM1（15±2.646）和MDM2（11±4.359）的两倍，差异显著；mock各组极少。结论：极化状态调节ASFV诱导的TNT样突起形成。
4 TNT样突起诱导在ASFV毒株间保守但存在显著毒株差异。研究人员筛查19株田间分离株及Ba71V（MOI=0.1，24 hpi，计数600个p72阳性细胞），全部20株均诱导突起；BE18最低（31.67±16.04/600），MFUE 6/1最高（206.7±110.2/600），且与基因型或毒力无关。一步生长曲线显示15 hpi MFUE 6/1胞外ASFV DNA显著高于BE18（45 600±20 819.78 vs 18 243.33±7355.19 copies/μL），突起细胞亦显著更多（156.00±57.30 vs 34.33±1.53/600）。Ba71V感染Vero细胞18 hpi（MOI=10）时，p72阳性突起细胞62.67±3.22/600，显著高于mock的1.67±0.58/600。结论：该表型跨ASFV毒株保守，但诱导程度呈毒株差异，并可在Vero细胞中复现。
讨论总结与结论翻译：讨论指出，巨噬细胞组织来源、成熟阶段和极化状态强烈影响ASFV诱导TNT样突起的能力；这些差异可能反映细胞分化及细胞骨架调控差异。Vero细胞可作为机制研究的实用补充模型；毒株间差异提示病毒和宿主因素共同调控TNT诱导。BE18诱导比例最低不能仅归因于体外传代或病毒滴度差异；条件培养基不能诱导mock细胞形成突起或改变BE18感染细胞的突起形成，提示需要生产性感染。NHV与L60遗传关系近，适合后续比较基因组分析。研究结论翻译：总之，巨噬细胞组织来源、成熟阶段和极化状态强烈影响其产生ASFV诱导TNT样突起的能力。这些差异可能反映细胞分化和细胞骨架调控的变化。Vero细胞为机制研究提供实用的补充模型，而毒株依赖性差异表明病毒和宿主因素均调控TNT诱导。综上，这些发现为ASFV诱导的膜重塑提供新见解，并为未来研究TNT样结构在病毒传播和致病机制中的作用奠定基础。
