## 中文标题 猪空肠派尔集合淋巴结白细胞是结合猪链球菌及suilysin的黏膜IgA的高效来源

《Veterinary Research》：Porcine jejunal Peyer’s patches leukocytes are a potent source of mucosal IgA binding to Streptococcus suis and suilysin

　　

人类猪链球菌（Streptococcus suis）感染常与食用未煮熟的猪肉相关，尤其在东南亚地区。实验证据表明，猪链球菌可穿越肠道屏障并在猪体内引起全身性感染，提示肠道可能是其潜在入侵部位。然而，针对猪链球菌的肠道黏膜免疫特征仍研究不足。本研究对8周龄常规饲养猪体内抗猪链球菌黏膜IgA的肠道来源及产生进行了初步探究。研究显示，空肠和回肠黏液中含有可识别共生猪链球菌分离株及强毒力猪链球菌cps2菌株的IgA。黏膜IgA抗体亦可结合分泌型毒力相关蛋白suilysin（SLY）。对空肠派尔集合淋巴结（JPP）和回肠派尔集合淋巴结（IPP）白细胞的流式细胞术分析显示，JPP中IgA⁺ B细胞频率显著更高。此外，JPP来源白细胞的基础性及刺激诱导性总IgA分泌量均高于IPP来源白细胞。以T细胞相关因子CD40L和IL-21或Toll样受体（TLR）1/2配体Pam3Cys-SK4刺激，均可诱导抗猪链球菌IgA分泌，尤其在JPP来源白细胞培养物中更为明显，提示固有免疫机制的参与及T细胞辅助的重要作用。最后，经体外刺激JPP或IPP来源白细胞所诱导的IgA可识别共生及强毒力猪链球菌以及参与破坏上皮屏障的SLY。研究结果提示，猪链球菌可激发常规仔猪肠道内的黏膜免疫应答，其中JPP中的B细胞是IgA产生的关键部位。

## 论文解读

**研究背景** 猪链球菌（Streptococcus suis）是健康猪黏膜表面的自然定植菌，其主要生态位为上呼吸道，尤其是扁桃体和鼻腔，但亦可于泌尿生殖道和胃肠道中检出。同时，猪链球菌亦为一种人兽共患病原，可致人类发生脑膜炎、败血症等严重致死性疾病。基于荚膜多糖（cps）差异已鉴定出29种血清型，其中cps2在全球范围内被认为是猪和人类临床意义最重要的血清型。荚膜多糖可保护细菌免受吞噬并调节宿主免疫应答。除荚膜外，多种表面相关蛋白和胞外蛋白亦参与其致病性，其中suilysin（SLY）为一种54 kDa的分泌型溶血素，属胆固醇依赖性溶细胞素家族，可在多种宿主细胞膜上形成孔道，导致细胞裂解和组织损伤；SLY存在于95%的欧洲和亚洲侵袭性cps2菌株中，可通过诱导上皮细胞骨架重排增强猪链球菌的黏附与侵袭能力，并干扰宿主免疫应答。SLY具有高度免疫原性，可诱导强烈抗体应答，但其在猪体内的保护效果各研究不一。IgA是黏膜表面主要抗体同种型，在塑造微生物组及防御侵袭性黏膜感染中起关键作用。派尔集合淋巴结（PP）是肠道相关淋巴组织（GALT）的主要诱导部位，在启动黏膜免疫应答尤其诱导IgA产生型B细胞中发挥核心作用。猪体内存在两类解剖学上不同的派尔集合淋巴结：形态学连续的回肠派尔集合淋巴结（IPP）于产前形成，而离散的空肠派尔集合淋巴结（JPP）于出生后发育并于断奶后显著扩增，二者结构差异与功能分化相关。在东南亚，食用未煮熟的猪血、肉及肠被证实为人兽共患猪链球菌感染的主要危险因素，由此引发一系列探究肠道是否为猪链球菌感染潜在入侵部位的研究。尽管肠道途径并非猪体内的主要定植途径，但研究自然储存宿主中的肠道黏膜免疫应答或可为人类人兽共患传播主要途径提供机制性线索。然而，据研究人员所知，针对猪链球菌的肠道黏膜免疫尚未见研究。基于上述考虑，研究人员假设派尔集合淋巴结是断奶仔猪中猪链球菌特异性IgA的重要来源。

**关键技术方法** 研究以8周龄常规饲养德国长白仔猪（来自德国Gro?p?sna的Oberholz教学研究农场，n=6）为对象，采集空肠与回肠黏液；采用SDS-PAGE与Western blot检测黏液IgA对重组猪链球菌蛋白的结合；以夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）定量总分泌型IgA（SIgA）及抗原结合性IgA；经酶消化与密度梯度离心分离JPP与IPP白细胞，行流式细胞术表型分析；以Pam3Cys-SK4或CD40L+IL-21体外刺激白细胞7天并检测上清IgA；辅以组织病理学与免疫组化分析。

**研究结果**

*常规断奶猪小肠黏膜IgA可结合共生及强毒力猪链球菌及SLY* 通过Western blot发现小肠黏液IgA及分泌型抗体对与猪无关的鼠类病原重组蛋白rRhiA无反应，而对猪链球菌蛋白SAO和SLY呈强结合，对IdeSsuis亦有弱识别，表明IgA选择性结合猪病原体。经夹心ELISA检测，6头8周龄猪空肠与回肠黏液均检出SIgA，空肠呈较高光密度趋势；血清总SIgA水平低，证实SIgA在肠道黏液中富集。ELISA进一步显示空肠与回肠黏液IgA均可结合共生猪链球菌分离株与强毒力cps2菌株，两肠段间无显著差异，且对SLY的反应性得到确认。由此提示，所研究仔猪小肠黏液中含可结合共生及强毒力猪链球菌抗原（包括SLY）的IgA，进而促使研究人员将派尔集合淋巴结作为抗猪链球菌IgA潜在来源加以探究。

*JPP较IPP富集IgA⁺ B细胞与CD3⁺ T细胞* 组织学比较显示IPP与JPP滤泡结构相当，滤泡内Bcl-6⁺细胞密集分布，提示组织良好的生发中心，Ki-67染色显示高增殖活性；CD3⁺ T细胞在JPP中似更丰富，分布于滤泡内及顶端滤泡间区。流式细胞术定量证实JPP中CD3⁺ T细胞频率显著高于IPP；CD79a⁺ B细胞在两组织中均占存活淋巴细胞的较高比例，IPP略高于JPP；而在B细胞群内，JPP中IgA⁺细胞比例显著高于IPP，表明IgA⁺ B细胞在空肠派尔集合淋巴结中富集。

*JPP来源白细胞较IPP具有更强的组成型及刺激诱导型IgA分泌* 将JPP与IPP白细胞培养7天或以TLR1/2配体Pam3Cys-SK4或T细胞相关因子CD40L+IL-21刺激后以ELISA检测上清总IgA。JPP白细胞可组成型分泌IgA，而IPP白细胞产量极微；CD40L+IL-21刺激使两组IgA分泌均增加；Pam3Cys-SK4刺激亦诱导IgA分泌，JPP培养上清呈较高水平趋势。与肠道黏液中IgA不同，分离白细胞培养上清中检出的总IgA不含SIgA。综上，JPP来源白细胞是IgA的高效来源。

*刺激后JPP来源白细胞是抗猪链球菌及SLY IgA的高效来源* 对体外刺激的JPP与IPP来源白细胞培养上清检测猪链球菌结合性IgA。培养基条件下上清中几乎检测不到结合共生菌株的IgA，而刺激后出现可测光密度，表明抗原特异性IgA被诱导；且JPP来源上清总体光密度高于IPP来源，提示共生猪链球菌结合性IgA分泌增加，该差异在Pam3Cys-SK4刺激下具统计学显著性，CD40L+IL-21呈相似趋势但因供体间变异未达显著。刺激亦诱导结合强毒力cps2及SLY的IgA，JPP来源上清总体光密度较高，但仅Pam3Cys-SK4诱导的SLY结合性IgA差异具统计学显著性，可能源于肠道总IgA浓度的个体间高变异。数据提示JPP白细胞是猪链球菌特异性IgA的高效来源，刺激后可产生强劲分泌。

**讨论与结论** 讨论指出，本研究证实8周龄常规猪肠道中已存在抗猪链球菌黏膜IgA，黏液IgA对多种猪链球菌抗原包括毒力相关毒素SLY及灭活共生与强毒力菌株呈明确反应性，提示猪肠道免疫系统在仔猪高度易感侵袭性疾病的早期即已启动抗猪链球菌IgA应答。早期黏膜抗猪链球菌IgA似为自身产生而非母源获得：被动转移的乳源SIgA在鼠肠道腔内半衰期短，且近期猪研究报道母源血清IgG随时间下降而结合猪链球菌表面的血清IgA上升；肠道黏液中存在抗原结合性IgA以及尤其JPP白细胞的高效产生，支持局部诱导黏膜免疫应答的观点。流行病学与实验研究提示克隆复合群1的猪链球菌cps2为人类食源性病原，且可穿越猪肠上皮；在此背景下，多数侵袭性菌株（包括cps2分离株）产生的溶细胞毒素SLY可能通过破坏上皮屏障完整性、诱导细胞骨架重排及促进细菌黏附侵袭而参与易位，高毒力菌株（包括与链球菌中毒性休克综合征STSS相关者）表达更高水平SLY。本研究中观察到的强SLY反应性IgA提示该毒力因子是猪早期黏膜免疫应答的主要靶标，黏液中的SLY结合性IgA可能作为重要第一道防线，通过结合该毒力相关因子限制其生物学活性，从而减少上皮损伤及细菌黏附侵袭；因此黏膜IgA不仅可靶向细菌表面结构，还可中和对致病至关重要的分泌型毒素。研究对JPP与IPP免疫细胞组成的部位特异性表征拓展了既往JPP T细胞频率较高、IPP B细胞比例略高的观察，进一步明确了B细胞群；JPP中IgA⁺ B细胞频率显著更高，提示两部位功能差异，与二者发育和功能分化相符。CD79a贯穿B细胞发育全程主要反映总体B细胞群，而IgA表达标识抗原经历型、类别转换型B细胞；既往研究显示JPP优先支持抗原驱动型B细胞分化与IgA类别转换，而IPP主要参与早期、 largely抗原非依赖性B细胞库的建立。功能上，JPP来源细胞组成型IgA分泌显著升高，与其较IPP更活化或致敏的基线状态一致，并对CD40L+IL-21刺激呈增强的反应性，可能反映T细胞依赖机制；实验体系中PP来源白细胞以含B与T细胞的混合群培养，保留了生理相关细胞互作，鉴于分离B细胞及PP来源细胞体外存活较差，此点尤为重要；JPP来源细胞对TLR刺激呈强反应性，提示固有信号对B细胞活化的实质贡献，其总体增强的反应性可能反映混合白细胞群内T细胞依赖与非依赖机制的协同互作。黏膜猪链球菌结合性IgA⁺ B细胞的T细胞依赖性支持其在断奶仔猪适应性免疫应答中的贡献；断奶后血清抗猪链球菌IgA及杀菌免疫的升高提示IgA在全身免疫中的潜在作用。总之，本研究将肠道鉴定为猪链球菌早期识别的免疫活跃部位，并突出JPP为抗猪链球菌IgA应答的高效诱导部位；观察结果提示T细胞辅助与固有信号可能塑造靶向猪链球菌及相关毒力因子（如SLY）的IgA生成。从转化角度看，鉴于肠道作为潜在入侵部位的作用及抗原特异性IgA的早期存在，旨在增强黏膜免疫的策略可能尤为有效；特异性刺激猪（并可能包括人）派尔集合淋巴结中的IgA⁺ B细胞或有助于预防猪链球菌肠道感染，诱导针对SLY等关键毒力因子强IgA应答的黏膜疫苗途径或为降低动物疾病负担与人兽共患传播的有前景方向。研究结论为：猪链球菌可激发常规仔猪肠道内的黏膜免疫应答，其中空肠派尔集合淋巴结中的B细胞是IgA产生的关键部位。