《Veterinary Research》：The genomic landscape of Pasteurella multocida B:2 causing haemorrhagic septicaemia in Germany
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出血性败血症（HS）是一种由多杀性巴氏杆菌（P.）multocida B:2和E:2血清群引起的超急性至急性、高致死性疾病，主要影响牛和水牛。由于其对畜牧生产和国际贸易具有显著的社会经济影响，牛和水牛的出血性败血症需向世界动物卫生组织（WOAH；原OIE）进行
出血性败血症（HS）是一种由多杀性巴氏杆菌（P.）multocida B:2和E:2血清群引起的超急性至急性、高致死性疾病，主要影响牛和水牛。由于其对畜牧生产和国际贸易具有显著的社会经济影响，牛和水牛的出血性败血症需向世界动物卫生组织（WOAH；原OIE）进行强制报告。在其他有蹄类动物中，多杀性巴氏杆菌B:2（iPmB:2）感染呈现相似的临床症状。2010年至2024年间，德国发生的一系列出血性败血症和iPmB:2疫情，要求对流行菌株的时空动态和分子特征进行详细调查。特异性地鉴定和分析流行血清型的能力对于确认疫情和实施适当的控制措施至关重要。在兽医实践背景下，研究人员于2010年至2024年间从德国死亡的家畜和野生动物中采集了共221株与HS/iPmB:2疫情相关的多杀性巴氏杆菌荚膜B:2型分离株，并随后利用全基因组测序进行分析。研究人员通过基于PCR的荚膜和脂多糖分型、多位点序列分型（MLST）以及高分辨率基因组比较对分离株进行了表征。研究评估了四种高分辨率分型方法，并与流行病学定义的疫情进行比较，以确定最适合疫情调查的方法。基于单核苷酸多态性（SNP）的分析显示出最高的区分能力和与已知疫情数据的最佳一致性，优于传统的多位点序列分型（MLST）和核心基因组多位点序列分型（cgMLST）方法。基因分型确定了八个主要遗传簇，涉及多个联邦州和宿主物种中密切相关的菌株。多个疫情由高度相似或相同的基因组相关联，提示该病原体在德国境内既存在局部持续存在，也存在更广泛的地理传播。
论文解读文章
研究背景与科学问题
多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）是一种革兰氏阴性、非运动性、兼性厌氧、多形态球杆菌，属于巴氏杆菌科（Pasteurellaceae）。该病原体具有感染多种动物物种的显著能力，从家畜到伴侣动物、家禽和野生动物，常作为共生菌无症状定植于上呼吸道和肠道黏膜。多杀性巴氏杆菌根据荚膜抗原分为五种荚膜血清群（A、B、D、E和F），并根据菌体抗原分为16种体细胞血清型。不同荚膜血清群与特定的疾病表现和宿主偏好密切相关，感染症状可从无症状或轻度慢性上呼吸道炎症到急性、常致死的肺炎和/或播散性疾病。
出血性败血症（HS）是由多杀性巴氏杆菌B:2和E:2血清群引起的影响牛和水牛的超急性至急性、高致死性疾病，被世界动物卫生组织（WOAH）列为须通报疾病。在其他有蹄类动物中，多杀性巴氏杆菌B:2感染（iPmB:2）呈现相似的临床症状。在德国，出血性败血症的通报和经济负担沉重的防控义务于1969年被废除，因为该病已不再被检出，且很可能仅零星发生。前东德曾有自己的出血性败血症通报立法，该立法于1990年10月德国统一后的1991年被废除。1949年至1991年间未报告任何病例。然而，自2026年3月10日起，出血性败血症在德国再次成为须通报疾病。
2010年至2024年间，德国发生了一系列令人担忧的出血性败血症疫情，这要求对流行菌株的时空动态和分子特征进行详细调查，以了解病原体的来源、传播和特征。特异性地鉴定和分析与出血性败血症相关的血清型的能力对于确认疫情和实施适当的控制措施至关重要。该研究旨在利用先进的基因组技术，基于德国出血性败血症杂交基因组，为德国多杀性巴氏杆菌B:2菌株开发高分辨率分型策略，填补这一关键空白。
研究设计与技术方法
研究人员共收集了2010年至2024年间由各州实验室鉴定并确认的221株多杀性巴氏杆菌B:2分离株，这些分离株来自德国死亡的家畜和野生动物，包括牛（n=136）、野猪（n=32）、猪（n=21）、黇鹿（n=13）、水牛（n=8）、鹿（n=5）、狼（n=5）和马（n=1）。所有分离株均进行了全基因组测序。研究人员从主要序列类型（ST64）中选择了一株分离株（24Y00006）进行额外的长读长测序，构建了完整闭合的参考基因组（24Y00006ref），用于高分辨率SNP分型。
研究评估了四种高分辨率分型方法：（i）基于核心基因组SNP（cgSNP）的分型；（ii）使用Gubbins进行重组过滤的cgSNP分型（SNP_Gub）；（iii）使用公开可用的pubMLST方案（包含1238个位点）的核心基因组多位点序列分型（cgMLST）；（iv）基于德国特异性ad hoc方案（包含1999个位点）的cgMLST（cgMLST_Ger）。所有方法均使用ChewBBACA和Chewiesnake流程进行等位基因分配和距离矩阵计算。分型性能通过Simpson多样性指数和调整兰德指数（ARI）进行评估，以流行病学定义的八个疫情（包含75株分离株）作为参考分组。
研究结果
多杀性巴氏杆菌B:2基因组的基因组特征
221株德国多杀性巴氏杆菌B:2分离株均完成了短读长测序，每株基因组至少产生60万条读段，最低覆盖度为69倍。组装过程产生19至49个重叠群，N50值范围为85.3至596.8 kbp。所有基因组均不含质粒复制子或已知的抗菌素耐药性遗传标记。基于基因组组装，预测所有分离株均为LPS群2和荚膜B型。根据RIRDC MLST方案，所有分离株均被分配至序列类型（ST）122。使用多宿主MLST方案，207株分离株被分类为ST64，而14株属于ST61，两种序列类型仅在aroA位点存在差异。
分型方法的评估
四种分型方法在0、1、5、10、20和50个SNP或等位基因的分层聚类阈值下进行了评估。SNP-based方法最有效地捕获了疫情结构。在阈值1时，SNP和SNP_Gub均产生38个分区，具有高多样性（Simpson指数=0.93）和与疫情定义的中等一致性（ARI=0.73）。将阈值增加到10可将分区数量减少至八个，Simpson多样性指数为0.87，同时将ARI提高至0.84，表明与定义疫情的一致性最高。重组过滤对聚类结果没有影响。cgMLST方法在5个等位基因及以上的聚类阈值下仅产生一个分区，区分能力有限。SNP-based方法在分辨率和流行病学一致性方面均优于cgMLST。
流行病学定义疫情的基因组特征
2010年首次疫情暴发于勃兰登堡州和萨克森-安哈尔特州的弗莱明荒原，至2013年已影响数百只动物，包括猪、牛、狍和黇鹿。该疫情的所有23株分离株在10-cgSNP阈值下均属于簇1，而2013年从同一地区分离的两株菌株属于簇5，表明是独立疫情。2017年巴伐利亚州发生两次疫情，15株分离株在10-cgSNP阈值下属于簇2。2019年巴登-符腾堡州发生疫情，20株牛源分离株在10-cgSNP阈值下均属于簇3。2018/2019年萨克森州鲍岑和格尔利茨地区发生疫情，所有四株分离株在10-cgSNP阈值下属于簇1。2021年和2022年萨克森州分别发生疫情，11株牛源分离株在10-cgSNP阈值下分为簇2（n=2）和簇6（n=9）。
德国多杀性巴氏杆菌B:2的基因组景观
使用10-cgSNP阈值的cgSNP分型将所有221株分离株分为八个包含至少三株分离株的簇。簇1是最大的群体，包含93株分离株，收集于2010年至2023年间，来自七个北部和中部联邦州。在0-cgSNP阈值下，簇1进一步分为13个亚簇，其中亚簇1包含35株分离株，跨越13年收集期，来自六个不同的州。簇2包含48株分离株，收集于2013年至2024年间，来自六个联邦州。簇3包含24株分离株，其中21株于2019年在巴登-符腾堡州卡尔夫市收集。簇4包含17株来自德国北部的分离株。簇5包含14株来自萨克森-安哈尔特州和勃兰登堡州的分离株。簇6包含12株分离株，其中九株来自萨克森州，三株来自勃兰登堡州。簇7包含10株分离株，其中九株于2018年至2023年间在梅克伦堡-前波莫瑞州收集。簇8包含三株完全相同的分离株，于2022年在梅克伦堡-前波莫瑞州分离。
与欧洲测序数据的比较
对序列读段档案的检索获得了来自七个欧洲国家、十二种不同宿主物种的49个样本的原始测序数据。LPS分析检测到五种不同的LPS群。来自匈牙利的两株分离株（pm4586和pm3987）与德国亚簇1的所有35株分离株在0-cgSNP水平上聚类，表明存在关联。另一株匈牙利分离株（P57）与来自勃兰登堡州和萨克森-安哈尔特州的四株分离株在0-cgSNP水平上聚类。
讨论与结论
该研究对221株德国出血性败血症/多杀性巴氏杆菌B:2感染分离株进行了全面的基因组分析。研究证实了传统MLST在区分密切相关的多杀性巴氏杆菌B:2分离株方面的分辨能力有限。基于10-cgSNP阈值的分层聚类提供了与德国分离株集合中定义疫情事件的最佳拟合。然而，该阈值需要在独立数据集中进行验证后才能被视为多杀性巴氏杆菌B:2的通用阈值。
研究结果表明，疫情通常由单一引入事件的局部扩张驱动。不同疫情和德国不同地理区域分离株之间的基因组关联提示存在潜在的流行病学联系。系统发育和空间分析表明，高度相似的多杀性巴氏杆菌B:2分离株在德国存在长期持续存在和地理传播。亚簇1这一遗传上统一的克隆在勃兰登堡州持续存在超过十年，并在14年间在另外五个联邦州被鉴定到。未观察到宿主特异性进化枝，表明多杀性巴氏杆菌B:2在德国的进化未导致宿主适应谱系，这种宿主泛嗜性行为反映了广泛的生态可塑性。
德国出血性败血症/多杀性巴氏杆菌B:2感染的重新出现和传播可能由生态和社会经济因素的汇聚驱动。2010年异常炎热的夏季，该病原体似乎从其地方性动物疫源地溢出至野生黇鹿，然后传播至围栏野生动物和农场动物。匈牙利和德国分离株之间的克隆关系提示跨界疫情可能存在人为起源。
研究结论指出：（i）传统MLST区分密切相关多杀性巴氏杆菌B:2分离株的分辨能力有限；（ii）基于10-cgSNP阈值的分层聚类提供了与德国分离株集合中定义疫情事件的最佳拟合；（iii）10-cgSNP阈值需要在独立数据集中进行独立验证后才能被视为多杀性巴氏杆菌B:2的通用阈值。未来的研究应纳入地理上更多样化的采样、纵向监测以及基因组数据与详细流行病学和生态学信息的整合。此外，缺乏有效疫苗不仅增加动物痛苦和严重的经济损失，还促进了疾病的传播。
