低临床风险患者博来霉素诱导性肺炎的多中心全基因组测序队列研究

《Molecular Genetics and Genomics》：A multicenter whole-genome sequencing cohort of bleomycin-induced pneumonitis in predominantly clinically low-risk patients

摘要 引言 博来霉素（Bleomycin）是治疗生殖细胞肿瘤（Germ Cell Tumours, GCT）和霍奇金淋巴瘤（Hodgkin Lymphoma, HL）根治性化疗方案的关键组成部分，但其应用受到博来霉素诱导性肺炎（Bleomycin-Induced Pneumonitis, BIP）的限制。尽管既定的临床风险因素可预测部分病例，但BIP也可发生于无这些风险因素的患者。临床前模型和小规模人体研究提示，药物代谢、氧化应激、免疫和纤维化通路可能参与易感性的形成。本研究旨在识别主要为低临床风险患者中BIP的胚系遗传贡献因素，以改进GCT和HL的风险分层。 方法 研究人员回顾性地纳入了21例尽管主要为低临床风险但仍发生具有临床意义BIP的患者（13例GCT，8例HL）。收集临床数据，并在可能的情况下获取血样进行全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS）。分析聚焦于一个基于文献综述中与BIP相关的基因/等位基因而制定的BIP风险基因组合，并结合了针对相关肺部及自身炎症/自身免疫病理学特征的多基因风险评分（Polygenic Risk Scores, PRS）。 结果 中位年龄分别为39岁（GCT）和49岁（HL）；67%为终生不吸烟者。大多数BIP患者的CTCAE分级<3级（76%），52%接受了皮质类固醇治疗。对18例个体进行了WGS。在制定的基因组合内的9个基因中观察到低频错义变异，尽管其意义尚不清楚。对12例欧洲裔个体的PRS分析显示，BIP与已建立的肺部疾病或自身炎症/自身免疫性疾病PRS均无关联。 结论 研究人员鉴定出了涉及肺表面活性物质生物学和炎症信号通路的、生物学上合理的候选胚系变异。这些探索性发现为未来研究BIP的遗传基础提供了候选基因和通路。

一、研究背景与目的

博来霉素（Bleomycin）是一种从轮枝链霉菌中分离出的糖肽类细胞毒性抗生素，通过诱导DNA链断裂、破坏核酸合成和抑制细胞分裂发挥抗肿瘤作用，是治疗生殖细胞肿瘤（Germ Cell Tumours, GCT）和霍奇金淋巴瘤（Hodgkin Lymphoma, HL）根治性化疗方案的基石。然而，其最令人担忧的并发症是博来霉素诱导性肺炎（Bleomycin-Induced Pneumonitis, BIP），临床表现从亚临床肺功能下降到进行性间质纤维化甚至死亡。现有报告显示，GCT患者中约10%可能发生BIP，而在HL中即使累积剂量较低也观察到相似或更高的发生率。

BIP的发病机制被认为涉及肺部微环境中的氧化应激，随后是免疫介导的肺泡损伤和修复失调导致纤维化。实验模型表明，纤溶酶原激活物抑制剂-1（Plasminogen Activator Inhibitor-1, PAI-1）的过表达与炎症性BIP后的羟脯氨酸含量和肺纤维化密切相关。此外，差异性的酶促失活起着关键作用：负责博来霉素解毒的博来霉素水解酶（Bleomycin Hydrolase, BLMH）在肺组织中的表达水平相对于其他器官较低，这种相对缺乏被认为是肺部易受博来霉素毒性影响的基础。遗传因素可能进一步改变这一风险，例如，BLMH基因多态性（SNP A1450G）与可变酶活性和增强的肺毒性有关，而血色病相关基因HFE中H63D的携带者在肺部积累细胞外铁，具有更高的BIP患病率。临床前和转化研究已将多种生物学通路与BIP联系起来，包括炎症信号（IL6）、纤维蛋白溶解（SERPINE1/PAI-1）、表面活性物质生物学（SFTPA2, ABCA3）、黏液纤毛清除（MUC5B）、端粒维持（TERT, RTEL1）、抗氧化防御（NFE2L2/NRF2）和先天免疫信号（TLR4）。

目前的BIP临床风险因素包括高龄、肾功能受损和累积博来霉素剂量。其中，肾功能受损被认为是最强的预测因子，因为博来霉素几乎完全通过肾脏清除。尽管存在这些临床风险因素，BIP仍然不可预测，并且可能发生在没有已知风险因素的个体中。在一项包含835名GCT患者的大型队列研究中，BIP总体发生率为6.8%，重要的是，其中2.5%的患者没有可识别的临床风险因素。新兴的基因组数据可能超越传统临床参数，完善风险分层，从而能够早期识别遗传易感患者，为其调整治疗方案提供依据。在这项探索性研究中，研究人员描述了一个全国性HL/GCT队列的临床特征，这些患者尽管大多缺乏常规风险因素却发生了BIP，并通过全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS）来研究与肺损伤和纤维化有关的候选基因和多基因结构。研究人员假设，发生BIP的主要为低临床风险患者可能携带有对该毒性的遗传易感性，对这些个体进行全基因组测序可能会识别出影响博来霉素代谢、肺纤维化或肺损伤通路的单个罕见变异或常见多基因变异。

二、主要技术方法

研究人员从澳大利亚9个治疗机构回顾性地识别了接受GCT或HL治疗后发生BIP的患者，纳入标准为既往有博来霉素暴露史且发生临床显著性BIP，排除高基线临床风险患者（eGFR ≤ 70 mL/min，累积博来霉素剂量 ≥ 400,000 IU，年龄 ≥ 70岁）。对18例患者的外周血样本进行全基因组测序（WGS），采用Illumina NovaSeq 6000平台进行150碱基对双端测序，最小深度30×。数据分析遵循GATK最佳实践指南，并针对一个基于文献综述制定的包含29个候选基因的BIP风险基因组合进行分析。此外，还对12例欧洲裔患者进行了多基因风险评分（PRS）分析，比较其与来自千人基因组计划的667例欧洲裔参考人群在38个与肺部疾病和自身免疫性疾病相关的PRS上的差异。

三、研究结果

1. 患者队列

共纳入21例患者，其中13例GCT（62%）和8例HL（38%）。GCT患者中位年龄39岁，HL患者中位年龄49岁。多数患者无吸烟史（67%）。大部分BIP病例为CTCAE分级<3级（76%）。有两例死亡，一例HL患者死于并发急性感染的BIP，另一例GCT患者在经历4级BIP后多年因COVID-19导致的缺氧性呼吸衰竭死亡，该死亡与博来霉素相关的肺纤维化有关。52%的患者接受了皮质类固醇治疗。在BIP诊断前，GCT患者中位博来霉素剂量为9次，HL患者为4次。18例患者提供了血液用于WGS分析。

2. 对BIP相关基因具有预测高影响的基因组变异

研究人员首先寻找预测的高影响变异，即在5个基因（MUC5AC、NFE2L2、SFTPA2和PARN）中发现了5个候选变异。经人工筛选后，MUC5AC的两个移码变异被认定为一个保持阅读框的单倍型而非有害；NFE2L2和SFTPA2的变异由于在人群中频率过高且后者被ClinVar标注为良性而被排除；PARN的剪接供体变异仅影响非蛋白质编码转录本。最终，没有发现可能与BIP相关的、经过筛选后仍保留的高影响变异。

3. 对BIP相关基因具有预测中等影响的SNV

研究人员分析了中等影响变异（如错义变异），经频率过滤（群体等位基因频率 ≤ 0.01）和序列比对核查后，在9个基因中保留了14个罕见错义变异，分布于11个样本中，每个变异仅存在于单个样本。值得注意的是，在两名患者中分别观察到了两个ABCA3基因的变异（rs141621969和rs45592239），这两个等位基因在一般人群中频率很低（分别为0.003和0.002），且此前已被报道与间质性肺病相关。此外，通过对常见变异的反向筛选，研究人员发现两个处于连锁不平衡状态的IL6ST基因变异（rs2228044和rs2228043）在BIP队列中显著缺失（观察到的等位基因频率为0.028，远低于预期的0.21和0.17），尽管此差异未经过多重检验校正。

4. 药物遗传学SNV

研究人员查阅了ClinPGx数据库中与所有原因博来霉素毒性相关的10个等位基因，所有等位基因均在队列中被观察到。其中，博来霉素水解酶（BLMH）的变异rs1050565（Ile443Val）值得关注，该变异与博来霉素毒性和疗效表型相关。在本BIP队列中，有2名纯合子和11名杂合子携带者，其C等位基因频率（0.41）相较于预期频率（0.29）有所富集，但未达到统计学显著性（p = 0.09）。

5. 基因间区的SNV

对TERT和TERC基因上游调控区域的分析未发现任何值得关注的变异。

6. 结构变异

对所有位于BIP基因组合内的预测结构变异（包括插入缺失、倒位和易位）进行检查后，均因其不可能产生有害效应或属于低质量调用而被排除。

7. 多基因风险评分（PRS）分析

对12例欧洲裔患者进行的PRS分析显示，在针对38种表型（包括肺部疾病和自身免疫/自身炎症性疾病）的PRS分布上，BIP病例组与参考人群之间没有显著差异。

四、讨论与结论

讨论总结

在这项多中心研究中，研究人员描述了21例尽管基线临床风险较低但仍发生BIP患者的临床和基因组特征。尽管未发现单一的高外显率变异，但在9个目标基因中鉴定出14个罕见的错义变异。MUC5B基因中的一个独特单倍型值得通过长读长测序验证，因为MUC5B多态性与纤维化性肺病的黏液调节异常有关。IL6ST基因中Gly148Arg-Leu397Val单倍型的缺失，鉴于gp130-STAT3信号通路在BIP发病机制中的作用，值得独立验证。ABCA3基因中的两个罕见变异此前已被报道与间质性肺病相关，这为进一步研究ABCA3在博来霉素治疗队列中的作用提供了依据。BLMH基因的rs1050565变异虽未达统计学显著性，但其在BIP队列中的富集提示博来霉素代谢的遗传变异可能影响个体间的毒性易感性。对端粒酶基因TERT和TERC上游调控区域的检查未发现感兴趣的变异。针对欧洲裔患者的PRS分析结果为阴性，但这不应被解释为反对遗传因素参与BIP易感性的证据，而是凸显了将源自常见基因组变异的PRS应用于罕见治疗毒性研究的挑战，以及缺乏未发生BIP的博来霉素暴露对照组的局限性。该研究的主要优势在于建立了临床注释的BIP患者胚系WGS资源，为未来合作研究奠定了基础。BIP的易感性可能由风险增强和风险缓解等位基因的复杂相互作用决定，这些等位基因在不同祖先群体中存在显著差异，可能导致治疗毒性的差异。更大规模的、整合基因组学、功能分析和详细表型的前瞻性真实世界研究和临床试验研究对于定义BIP和其他毒性的生物学决定因素至关重要。

研究结论翻译

在这项探索性研究中，研究人员未能确定一个统一的基因组信号来解释为何BIP会发生在主要为低风险的患者中，这突显了该毒性的复杂性和可能的多因素性质。尽管在影响表面活性物质生物学和炎症信号传导的基因中观察到了一些生物学上合理的变异，但这些发现仍是假设生成的，需要验证。全球数据集的汇集对于增加统计效力是必要的，为此，研究人员已将WGS数据存入欧洲基因组-表型档案库以促进合作。