《Neotropical Entomology》：Antibiotic Treatment Reduces Wing Size and Alters Wing Shape in a Neotropical Drosophila (Diptera: Drosophilidae)
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## 三、摘要翻译
抗生素（antibiotics）被广泛用于昆虫—微生物相互作用研究，尤其是用于探究共生关系。然而，抗生素暴露也可能诱导意料之外的生理与发育效应。四环素（tetracycline）常被用于从不同宿主中清除Wolbachia，从而实现感染品系
## 三、摘要翻译
抗生素（antibiotics）被广泛用于昆虫—微生物相互作用研究，尤其是用于探究共生关系。然而，抗生素暴露也可能诱导意料之外的生理与发育效应。四环素（tetracycline）常被用于从不同宿主中清除Wolbachia，从而实现感染品系与未感染品系之间的比较。但该处理也可能影响宿主的微生物群（microbiota）、生理及基因表达。本研究在三个不同世代中评估了四环素对339只雄性Drosophila prosaltans翅尺寸与翅形的影响。将一个原始同雌品系（isofemale line）划分为若干亚系（sublines），接受连续四代抗生素处理，随后进入恢复世代，在此期间重建微生物群，包括用未处理雄虫粪便进行再接种。几何形态测量学（geometric morphometrics）分析显示，所有处理亚系的翅尺寸均显著减小，且该效应在微生物群恢复后仍然持续。所有亚系在四代抗生素处理后翅形均发生改变，其中两个亚系在恢复后回到原始翅形。上述结果提示，四环素效应可延续数个世代，可能源于肠道微生物群与基因表达的改变。此类持久效应可能具有更广泛的表型后果，在解释使用抗生素开展宿主—共生体相互作用研究时应予以考虑。
图形摘要：四环素处理清除了Wolbachia并缩小了翅尺寸，同时改变了翅形，这些效应在微生物群恢复后并未完全逆转。各亚系间的形态学响应存在差异，表明抗生素效应在细菌重新定殖后仍持续存在。
## 四、论文解读
**研究背景与问题**
昆虫持续暴露于抗生素环境中，其来源包括药物不当处置，以及在动植物生产中用于控制传染性病原体的施药。抗生素在农业中被用于促进动物生长、防治植物细菌病害以及控制虫媒疾病，致使其在环境中的存在日益增加。尽管抗生素有益于农业、科学研究与疾病治疗，但也可能对个体产生负面效应，其原因在于细菌与真核生物线粒体（mitochondria）在生化上的相似性，尤其是核糖体（ribosome）层面；抗生素暴露可干扰线粒体蛋白合成。在昆虫饲养中预防性使用抗生素可增加幼体死亡率、改变发育时间、信息素产生、脂肪酸或氨基酸水平并降低生育力。在Chrysomya albiceps中，中高浓度抗生素超出个体解毒能力，导致寿命缩短。抗生素还可改变基因表达模式，主要影响处理个体的免疫与消化系统，并可能影响性识别相关因子的表达，使处理个体对雌性吸引力下降。
Wolbachia与节肢动物相互作用研究是依赖抗生素使用的主要实验体系之一。Wolbachia属Rickettsiales，存在于约52%的节肢动物物种中，分布于肠道、马氏管、脂肪体、肌肉、脑及生殖器官等多种宿主组织，主要经雌性垂直传播给后代，并可诱导多种提高感染雌性适合度的生殖表型，包括雌性化、孤雌生殖、雄性胚胎死亡与胞质不相容性。由于Wolbachia亦可感染脑部，有证据表明其干扰宿主生殖行为；此外Wolbachia还可能提高感染雌性生育力、提供抗病毒保护并支持环境中有限营养的获取或利用。研究Wolbachia诱导的表型需要未感染品系，通常通过四环素或利福平等化合物处理建立。四环素广泛用于研究Wolbachia与不同果蝇物种的相互作用，但可对处理宿主产生多种负面效应：与脊椎动物和无脊椎动物中线粒体效率降低及蛋白稳态破坏密切相关；在Drosophila simulans中直接损害线粒体功能并降低ATP合成；多世代四环素处理可改变基因表达，尤其是与免疫和消化系统相关的基因；在蜱中四代四环素暴露造成肠上皮损伤从而损害取食。鉴于这些负面效应，感染雌性生育力提高、营养吸收改善及行为改变等发现，实际上可能反映的是建立未感染品系所用抗生素处理的后果。因此，处理品系中观察到的负面结果可能并非直接源于Wolbachia清除，而是四环素的生理效应，可能导致实验结果误读。
基于上述潜在副作用，本研究探究四环素处理是否改变Drosophila prosaltans（一种携带Wolbachia菌株wPro的新热带果蝇）的翅形态。由于翅在交配与求偶中起关键作用，研究以雄性翅作为处理潜在适合度相关后果的替代指标。鉴于肠道微生物群影响宿主发育与生理的多个方面，研究利用未处理雄虫粪便向处理个体重新引入自然微生物群以试图恢复自然微生物群，从而将微生物群介导的翅形态效应与四环素的直接或残留效应区分开来。因此，本工作分离了四环素对翅形态的效应（独立于微生物群影响），提供了评估跨世代抗生素暴露后果的受控框架。
**主要关键技术方法**
研究采用2016年采自Vi?osa联邦大学校园大西洋森林城市片段、室内维持约80代的D. prosaltans同雌品系Pro 101，将其分为六个亚系独立处理。通过常规PCR检测wsp基因与线粒体COI基因以判定Wolbachia感染状态；以0.03%四环素培养基连续处理四代，随后两代无抗生素标准培养基、两代补充原始品系雄虫粪便的培养基进行微生物群恢复，再维持四代标准培养基。对G00（对照）、G04（抗生素处理、微生物群耗竭）与G12（抗生素处理、微生物群恢复）三代共339只右翅进行几何形态测量学分析，采用TpsDig标记I型解剖地标、MorphoJ进行Procrustes叠合与 centroid size 计算，并以R的geomorph等包进行统计分析。
**研究结果**
*抗生素处理与Wolbachia检测*：亚系的四代四环素处理于2023年5月至10月间完成，每代约30天。至第三代处理时，六个亚系中Wolbachia均已无法经常规PCR检出，该缺失在第四代即最后处理代中保持，证实处理有效。四代恢复于2023年10月至2024年2月进行，第一恢复代中L5亚系因未产生幼虫而丢失，止于G05，该模式与四环素处理及微生物群破坏相关的可能适合度代价相一致。四个恢复代之后及所有后续世代中，Wolbachia在测试的各亚系个体池中均保持不可检出，提示处理有效大幅降低或消除了Wolbachia感染。
*质心尺寸变异*：抗生素处理显著降低质心尺寸（F(2, 336) = 31.19，p < 0.001）。尺寸减小同时出现在微生物群耗竭的G04与微生物群恢复的G12个体中（G04?G00：估计值 = ?0.116，p < 0.001；G12?G00：估计值 = ?0.138，p < 0.001），而两个抗生素处理世代之间无显著差异（G12?G04：估计值 = ?0.022，p = 0.067）。在所有亚系中，G04与G12的质心尺寸均小于对照G00。G04与G12之间的比较显示亚系间存在差异：L1和L4中恢复微生物群的世代尺寸更小（估计值分别为?0.090与?0.079，p < 0.001）；L2中相反，耗竭世代尺寸更小（估计值 = 0.048，p = 0.011）；L3和L6中两代间无差异（估计值分别为0.004与0.008，p = 0.976与p = 0.9）。
*翅形变异*：跨世代翅形分析显示显著的异速生长效应（3.90%，p < 0.0001）。主成分分析前两个主成分合计解释33.9%的总翅形变异，PC1解释18.94%，PC2解释14.96%。对捕获超过95%翅形变异的前17个主成分进行多变量方差分析，结果表明抗生素处理诱导了世代间显著的形态分化（F = 4.55；Z = 4.92；p = 0.001）。事后两两比较证实所有世代对之间翅形差异显著（G00 vs. G04：p = 0.004；G00 vs. G12：p = 0.001；G04 vs. G12：p = 0.001）。所有组间的一致分化提示抗生素暴露效应无法与微生物群清除效应相区分；且对照G00与微生物群恢复的G12间显著形状差异表明，形态改变在微生物群重建后依然存在。
五个亚系的几何形态测量分析揭示了异速生长与翅形变异的独特模式。由于L1、L3、L4和L6中异速生长显著，其主成分分析基于形状对尺寸的回归残差；L2中异速生长不显著，则使用协方差矩阵。分析显示抗生素处理与微生物群恢复的效应在亚系间存在差异：微生物群耗竭的G04在所有亚系中均表现出与对照显著不同的翅形，而对微生物群恢复的响应呈品系依赖性。L1中，对照G00与耗竭世代G04间（p = 0.009）以及耗竭G04与恢复G12间（p = 0.019）翅形差异显著，但恢复组G12与对照G00间无显著差异（p = 0.126），表明微生物群恢复导致回到对照形态；该模式提示再定殖在恢复对照表型之前相对G04产生了额外的形状位移。相反，L2、L3和L4显示所有世代对之间均差异显著（p < 0.01），表明形态改变持续存在且未被微生物群恢复所解决。L6中呈现第三种模式：仅在对照G00与微生物群耗竭组G04间发现显著形状差异（p = 0.029），G04与G12间无显著差异（p = 0.123），说明初始改变在再定殖后被完全逆转，即直接向对照形态恢复而无L1那样的中间位移。
**讨论与结论**
本研究评估了用于清除Wolbachia的四环素处理对D. prosaltans翅尺寸与翅形的影响。结果显示所有处理亚系与世代中尺寸均显著减小，该减小表明抗生素处理影响了翅尺寸，且该效应未被微生物群恢复所逆转。关于翅形，所有亚系在微生物群耗竭的G04世代均表现改变，恢复后两个亚系回到对照的初始形状；五个亚系中有三个的恢复不足以恢复原始形状。上述模式与微生物群破坏和抗生素暴露相关的效应一致，提示抗生素诱导的破坏对翅形态具有持续效应，且恢复过程可能产生了不同于原始的微生物群。
所有亚系中即使在微生物群恢复后仍观察到的持续尺寸减小，提示抗生素处理具有持久影响。这种持续减小可能与四环素诱导的肠道形态改变损害营养吸收效率有关；此外抗生素暴露可改变与必需代谢、消化和免疫通路相关基因的表达，其效应可能传递给后续世代。上述机制共同提示四环素暴露可能诱导长期生物学效应，可能涉及表观遗传调控改变或发育轨迹的持久改变。长期抗生素暴露可能以在停止处理后仍产生稳定表型位移的方式扰乱代谢与调控通路；虽然本研究未直接检验这些机制，但其为观察到的持续形态模式提供了合理解释。此外，一个处理亚系L5未能延续至第五代之后，虽然具体原因无法确定，但该模式与抗生素暴露潜在适合度代价相一致，进一步提示四环素处理可能对处理个体施加持久的生物学限制。
关于翅形，所有亚系在G04世代均表现相对对照的改变。研究者预期微生物群恢复后回到初始对照形状，但仅五个亚系中的两个如此。所观察到的形态差异提示抗生素可能对个体发育产生负面效应。Wolbachia的消除也去除了生物体内存在的其他细菌如肠道微生物群，可导致营养吸收与产生方面的缺陷；此外抗生素处理后的再定殖可能导致微生物群多样性不同于原始群落。尽管本研究未直接评估微生物群群落变异，此类组成变化可能构成促成所观察模式的额外机制。因此，与抗生素处理相关的微生物群破坏可能促成了G04世代的形状差异；再定殖后G12世代的微生物群组成可能与对照G00不同，该差异也可能促成了某些亚系中观察到的持续形状分化。即使亚系共享相同遗传背景，与必需代谢通路相关基因表达的变异也可能影响所观察到的翅形差异，且这些差异可能在抗生素暴露结束后持续存在或消失。
四环素对亚系尺寸减小与翅形态的效应对其在实验中的使用具有重要意义。在果蝇中，雌性倾向于选择较大的雄性交配，以尺寸作为生殖质量的替代指标；此外交配期间雄性通过振动翅产生声音作为求偶组成部分，该行为是D. prosaltans成功交配的基础。翅尺寸与形状的变异可改变所产生的声音模式，从而影响雌性择偶。因此，处理诱导的翅尺寸与形状改变可能影响处理雄性的求偶表现，为未来择偶实验提示了有趣方向；评估该影响时，偏好测试应比较未处理雄性与经肠道微生物群恢复但翅形态不同的处理雄性。
使用抗生素评估Wolbachia与其宿主关系的研究倾向于将观察结果仅归因于共生体清除。然而，即使在宿主未感染Wolbachia的研究中，抗生素处理也可产生诸如改变果蝇翅不对称性、改变蝇类基因表达模式以及损害蜱类食物消化等效应。与多数仅评估单一处理品系的研究不同，本研究检查了共享相同遗传背景的亚系，揭示了效应表现的独特模式。因此，结果强调了考虑抗生素处理超出Wolbachia清除之外效应的重要性。需注意本研究仅评估雄性，用于清除Wolbachia的四环素处理效应可能在性别间存在差异，故所观察的形态模式不能直接推广至雌性或整个物种，需涵盖两性的进一步研究来阐明这些发现是性别特异性的还是适用于整个物种。
重要的是，所观察的表型模式可能反映多种非互斥机制。效应可能源于Wolbachia清除本身，因已知内共生体影响宿主代谢、营养分配与发育稳定性；或者同时源于四环素暴露的直接或间接效应，包括线粒体功能障碍、基因表达改变与长期代谢紊乱。由于抗生素处理同时消除Wolbachia并扰动宿主细胞与微生物过程，解析这些通路本身具有内在困难。尽管进行了微生物群恢复以最小化微生物清除的效应，仍无法完全分离Wolbachia消除的效应与抗生素暴露的效应。明确旨在分离这些组分的设计需要多个独立的处理与未处理品系，这虽有信息量，但会削弱本研究在各亚系间保持共享遗传背景的实验方法优势。恢复期L5亚系的丢失进一步支持四环素暴露结合微生物群破坏可能对处理个体施加显著生物学代价的可能性。因此，此处观察到的持续形态改变更合理地由共生体清除与抗生素处理的联合效应解释，而非任一因素独立作用。
研究结论（翻译）：研究人员的发现表明，四环素处理将Wolbachia降低至PCR不可检出水平，并与D. prosaltans中即使在微生物群恢复后仍持续的持久表型改变相关。考虑到翅在求偶与声信号传递中的核心作用，此类改变可能对包括择偶在内的行为结果产生重要后果。抗生素在自然环境中日益普遍，提高了生物在野外条件下也可能经历长期表型效应的可能性。总体而言，结果强调了一个关键点：抗生素处理后观察到的表型差异可能不仅反映微生物群或共生体清除，也反映抗生素暴露本身的持久效应。因此，宿主—共生体研究中的解释应谨慎进行，并明确考虑抗生素诱导的宿主形态、生理与行为潜在效应。
