微生物源生物除草剂：整合生物加工、作用机制与蛋白质工程以实现可持续杂草管理

《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：Microbial bioherbicides: Integrating bioprocessing, mechanisms of action and protein engineering for sustainable weed management

合成除草剂在农业中的广泛使用加剧了对环境可持续性和人类健康的担忧，同时抗药性的演化速度已超过新型作用机制的发现速度。因此，生物除草剂作为一种可行的替代方案应运而生，它包含能够抑制杂草生长的生物源化合物。本综述采用整合视角审视微生物源生物除草剂，追踪活性生物分子从生产菌株及其发酵条件到其在植物体内的生理靶点，再到可用于其优化的分子策略。与以往分别讨论这些维度且主要关注次级代谢产物的综述不同，本文特别强调具有除草活性的酶类以及蛋白质工程方法。基于结构化的文献检索，共分析了39篇原创研究。植物病原真菌（主要是镰刀菌属Fusarium、间座壳属Diaporthe、茎点霉属Phoma、链格孢属Alternaria和木霉属Trichoderma）是主要的产生菌，其次是链霉菌属Streptomyces、假单胞菌属Pseudomonas和芽孢杆菌属Bacillus的细菌，而使用低成本农工底物的深层发酵是主流的生产策略。角质酶、脂肪酶、纤维素酶、果胶酶和蛋白酶等酶类主要通过降解角质层和细胞壁发挥作用，而次级代谢产物则常靶向光合机构，特别是光系统II（photosystem II）；然而，在现有的除草剂分类体系中，大多数此类化合物仍缺乏明确的定义作用模式。异源表达、分子对接和代谢工程等分子方法尽管在提升活性、稳定性和特异性方面潜力巨大，但相对而言仍未得到充分探索。配方稳定性、生物工艺可放大性、机制表征以及监管协调方面的进展被确定为将这些生物分子转化为用于可持续杂草管理的商业化产品的关键需求。

引言

杂草是作物生产的主要生物问题之一，通过与作物竞争光、水和养分等必需资源造成产量损失。为了减少入侵性植物侵害，基于除草剂的杂草管理已成为现代农业最广泛采用的策略之一。全球除草剂市场超过450亿美元，而对大多数已知除草剂作用模式的抗性已有报道，这凸显了对替代性杂草控制策略的迫切需求。这种情况重新激发了人们对基于生物的杂草管理策略的兴趣，尤其是依赖天然产物和微生物代谢物的策略。与常规化学除草剂不同，这些化合物通常具有复杂的化学结构，可能通过与现有合成除草剂不同的机制起作用，从而潜在地降低交叉抗性。生物除草剂定义为来源于微生物或植物的制剂，其活性依赖于源生物体产生的酶、次级代谢物和其他生物活性分子，已被视为一种有前景的替代方案。尽管如此，生物除草剂的采用面临重大挑战，主要涉及其生产生物过程的复杂性以及对其作用机制和特异性谱系的理解有限。在此背景下，微生物生物除草剂成为一种特别有前景但仍未充分开发的策略。本综述旨在提供一个关于微生物生物除草剂的整合概述，连接生物加工、作用机制和蛋白质工程，具体目标包括：（i）描述生物除草剂分子的主要微生物来源及获取它们的发酵策略和培养条件；（ii）讨论负责植物毒性的酶和代谢物的作用机制，重点是其对植物代谢和结构过程的影响；（iii）考察如何应用蛋白质工程和现代分子工具来增强这些生物分子的活性、稳定性和特异性；（iv）识别当前限制微生物生物除草剂开发和商业化的主要挑战，并勾勒未来研究的前景。

文献计量学分析

检索于2025年3月在Scopus、PubMed和Wiley Online Library数据库中进行，旨在识别报告生产、鉴定或优化具有除草活性的微生物源生物分子的原创研究。初始检索共获得1213条记录。经过发表年份（2005-2025）、文献类型（仅保留英文原创研究文章）筛选后，剩余667条记录。随后通过标题和摘要筛选，排除所有仅基于植物提取物的研究，并对剩余记录进行全文阅读和分析。最终，共有39篇原创文章符合所有标准并被纳入本综述。对纳入研究的每篇文章提取了以下信息：微生物来源、培养基、发酵类型和操作条件、鉴定的生物活性分子或酶、目标杂草种类、施用浓度以及报告的植物毒性效应。使用VOSviewer对39篇选定文章的关键词进行了共现分析。共现图谱显示网络围绕“生物除草剂”（bioherbicide）这一术语组织，聚类算法识别出的分组与本综述涉及的生物除草剂开发阶段紧密对应，包括生物加工、酶生产与表征、植物毒性及作用机制、次级代谢物勘探以及分子与蛋白质工程。图谱中两个值得关注的方面是：生物加工与代谢物勘探聚类之间的强联系，以及遗传和蛋白质工程相关术语的边缘化位置。

微生物生物除草剂分子的来源

根据Ocán-Torres等人（2024），通过微生物发酵开发生物除草剂可分为四个不同阶段：（I）微生物的分离与初步筛选；（II）代谢物表征与配方优化；（III）温室毒性评估；（IV）生物投入品的放大与纯化。从叶片或根际分离具有坏死斑点的微生物是筛选能够破坏植物结构的植物毒性因子的基本步骤。关于微生物作为生物除草剂应用的研究大多基于植物病原真菌，其中镰刀菌属Fusarium spp.、间座壳菌Diaporthe schini、茎点霉属Phoma spp.、链格孢属Alternaria spp.和木霉属Trichoderma spp.是最常被引用的属。假单胞菌属Pseudomonas、链霉菌属Streptomyces和芽孢杆菌属Bacillus的细菌也时有出现，但比例低于真菌物种。生物除草剂的生产取决于获得过程的生物工艺优化，发酵技术的选择是决定经济可行性的关键因素。最广为人知的方法是深层发酵（Submerged Fermentation, SbF）和固态发酵（Solid-State fermentation, SSF）。培养基成分也影响生物分子的获取。碳分解代谢物阻遏（Carbon Catabolite Repression, CCR）和氮分解代谢物阻遏（Nitrogen Catabolite Repression, NCR）是微生物调节次级代谢物和酶生产的机制。微量元素如镁离子（Mg²⁺）作为多种酶的辅因子，影响微生物生长。pH值和温度等参数也影响酶和其他代谢物的生产。寻求可持续和低成本的发酵过程推动了对农工废弃物作为发酵底物的价值化利用，将循环经济理念引入生产过程。

微生物生物除草剂的作用机制

应用粗发酵液可能会混淆基于微生物的除草剂所引起的作用机制，因为提取物可能含有作用于多个作用位点的不同生物分子。一些酶和次级代谢物能够降解细胞壁等结构组分，并作用于靶标生物必需代谢的生物分子，抑制其生长和繁殖。合成除草剂的作用机制分类由除草剂抗性行动委员会（Herbicide Resistance Action Committee, HRAC）监管。大多数生物除草剂没有传统的HRAC编码，因为它们通常与接触性损伤相关，如细胞壁或膜破坏。在生物除草剂研究中观察到的主要作用机制涉及光系统II（photosystem II, PSII）的抑制。在这种情况下，光合活性的降低是由于电子传递的减少。类胡萝卜素是生物除草剂研究的另一个关键靶标，它们负责保护叶绿素分子免受活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）诱导的氧化损伤。通过发酵过程获得的酶也可以在细胞过程中发挥作用，例如超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）、过氧化氢酶（Catalase, CAT）和过氧化物酶（Peroxidase, POD）参与植物的防御系统，其主要功能是清除ROS。然而，当植物细胞重要组分发生氧化时，一些酶表现出不规则的活性，反而抑制其他酶的活性，导致细胞内过氧化氢积累。生物除草剂遇到的主要屏障是杂草的角质层、细胞壁和质膜。叶片角质层由聚酯脂质基质（角质）组成，是内部结构与外界环境之间的主要屏障。某些微生物，如镰刀菌属Fusarium spp.，可以分泌角质酶，水解角质链之间的酯键，导致角质层降解。其他酶如脂肪酶也可用于降解植物表面屏障。此外，纤维素酶、果胶酶和蛋白酶等细胞壁降解酶协同作用，破坏细胞壁完整性，使植物毒性化合物更易进入细胞内部。次级代谢物如细交链格孢酮酸（Tenuazonic acid, TeA）和胶霉毒素（Gliotoxin）能够中断电子流，导致ROS产生和细胞死亡。

蛋白质工程与分子优化

异源表达、分子对接和代谢工程等分子方法在提升活性、稳定性和特异性方面潜力巨大，但在当前文献中相对未被充分探索。蛋白质工程可以通过定向进化或理性设计来改造酶的结构，以提高其催化效率、热稳定性或底物特异性。例如，通过定点突变改变活性位点氨基酸残基，可以增强酶与底物的结合亲和力。分子对接技术可用于预测生物除草剂分子与其靶蛋白之间的相互作用模式，从而指导化合物的优化设计。代谢工程则可通过调控微生物宿主的代谢通路，提高目标生物分子的产量。例如，在链霉菌属Streptomyces中，通过过表达关键生物合成基因或敲除竞争性途径，可以显著增加具有除草活性的次级代谢物的积累。此外，将来自难培养或生长缓慢微生物的除草活性酶基因克隆至易于操作和发酵的宿主（如大肠杆菌Escherichia coli或酵母）中，是实现规模化生产的重要策略。

挑战与未来展望

目前限制微生物生物除草剂商业化的主要瓶颈包括配方稳定性差、生物工艺放大困难、田间效果不一致以及对作用机制和环境归趋的认识不足。许多生物活性分子在储存或田间条件下容易降解，需要开发微胶囊化、乳化或添加稳定剂等先进的配方技术来延长其货架期和田间持效性。从实验室规模到工业规模的发酵过程放大涉及氧气传质、热量移除和剪切力控制等工程难题，需要系统的工艺优化。田间效果的不可预测性源于环境因素（如温度、湿度、紫外线辐射）对生物分子活性的影响，以及对杂草种群的差异敏感性。最后，对大多数微生物生物除草剂分子的作用机制、非靶标生物毒性及土壤残留行为的了解仍然有限，这给产品注册和风险评估带来了不确定性。未来的研究应致力于整合多组学手段揭示新的作用靶点，发展绿色高效的生物制造平台，并通过跨学科合作解决从实验室到田间的转化鸿沟。