内侧前额叶皮层与海马向丘脑中线和鼻周皮层的投射：大鼠双逆行示踪研究

《Brain Structure and Function》：Projections from medial prefrontal cortex and hippocampus to midline thalamus and perirhinal cortex: a double retrograde tracing study in rats

　　

位于丘脑腹侧中线的连合核（nucleus reuniens，RE）、丘脑室旁核（paraventricular nucleus of the thalamus，PVT）和鼻周皮层（perirhinal cortex，PRC）均与内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex，mPFC）和海马（hippocampus，HPC）存在双向联系，可能作为中继结构调控mPFC与HPC之间的相互作用。为更深入地了解mPFC和HPC各亚区中投射至连合核旁核（peri-reuniens nucleus，periRE）、丘脑室旁核后部（posterior PVT，pPVT）和PRC的神经元的解剖学结构，研究人员将荧光逆行示踪剂CTB-AF488或CTB-AF594分别单侧注射至pPVT与PRC（实验1），或注射至pPVT与periRE（实验2）。随后在mPFC-HPC网络的相关区域检查细胞标记情况，包括前边缘皮层（prelimbic cortex，PL）、下边缘皮层（infralimbic cortex，IL）、背侧和腹侧CA1（dorsal and ventral CA1，dCA1和vCA1）以及背侧和腹侧下托（dorsal and ventral subiculum，dSub和vSub）。研究结果表明，mPFC向periRE或pPVT的投射总体上在同侧更为显著，但IL向pPVT的投射未见偏侧化，且多数投射起源于深层。mPFC向PRC的投射未见偏侧化。就HPC而言，多数投射至PRC的细胞位于同侧的vCA1和dSub。HPC向periRE或pPVT的投射总体上未见偏侧化，但vSub向pPVT的投射在同侧更为显著。最后，在两个实验所检查的所有区域中，侧支投射细胞均较为稀疏。

**研究背景与问题提出**

内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex，mPFC）与海马（hippocampus，HPC）之间的协同活动支持工作记忆、情景记忆和情绪调节等高级认知过程。mPFC位于皮层层级结构的中心位置，参与决策与执行控制；HPC则在记忆巩固和空间导航中发挥关键作用。HPC沿背腹轴存在解剖学分隔，背侧HPC（dorsal HPC，dHPC）主要参与记忆过程，腹侧HPC（ventral HPC，vHPC）更多与情绪调控相关。解剖学上，vHPC向mPFC的前边缘皮层（prelimbic cortex，PL）和下边缘皮层（infralimbic cortex，IL）发出直接而大量的投射，然而mPFC并不存在返回HPC的直接投射。为完成mPFC对HPC的反馈调控，需要由特定中继节点介导的间接多突触环路。在多个中介脑区中，连合核（nucleus reuniens，RE）、丘脑室旁核（paraventricular nucleus of the thalamus，PVT）和鼻周皮层（perirhinal cortex，PRC）均与mPFC和HPC存在双向联系，可能承担桥接mPFC-HPC通讯的作用。因此，深入理解这些中继枢纽如何门控mPFC与HPC之间的信息流，有助于阐明支持执行-记忆整合的网络架构。

RE位于丘脑腹侧中线，是支持工作记忆和行为灵活性的前额叶-丘脑-海马神经网络的关键节点。已有证据表明，RE尤其是连合核旁核（peri-reuniens nucleus，periRE）向PL和IL发出密集投射，而PL和IL的返回投射主要靶向periRE。RE优先支配腹侧CA1（ventral CA1，vCA1）及背侧和腹侧下托（dorsal and ventral subiculum，dSub和vSub），对背侧CA1（dorsal CA1，dCA1）的投射相对较弱。此外，部分RE神经元发出同时投射至mPFC和HPC的侧支投射，提示RE是参与mPFC与HPC相互作用相关功能的关键节点。PVT位于丘脑背侧中线，调控与慢性应激、情绪学习和动机行为相关的多种信息流，并在前后轴上呈现不同的解剖学梯度。在mPFC内，前部PVT（anterior PVT，aPVT）和丘脑室旁核后部（posterior PVT，pPVT）均与PL和IL相互联系，但连接模式不同；在HPC内，aPVT和pPVT均投射至vSub，但aPVT接受来自vSub的返回投射更强。PRC位于内侧颞叶，通过与内嗅皮层的连接充当连接海马结构与皮层环路的门户，参与识别记忆和恐惧条件化，其中mPFC、HPC和PRC形成的网络对识别记忆加工至关重要。PRC与PL和IL存在双向联系，海马向PRC的输入来自vCA1、vSub和dSub，dCA1的投射稀疏。

基于研究人员聚焦于mPFC投射的研究兴趣，本研究选择periRE和pPVT作为潜在中继站，旨在更细致地比较mPFC和HPC各亚区分别投射至periRE、pPVT和PRC的神经元以及侧支投射情况。研究采用双神经元逆行示踪方法，将结合Alexa Fluor 488的霍乱毒素B亚单位（cholera toxin subunit B conjugated with the Alexa Fluor 488，CTB-AF488）或结合Alexa Fluor 594的霍乱毒素B亚单位（CTB-AF594）分别单侧注射至雄性Long-Evans大鼠的pPVT与PRC（实验1）或pPVT与periRE（实验2），并在mPFC的PL和IL以及HPC的dCA1、vCA1、dSub和vSub中采样并量化单标记和双标记神经元。

**关键技术方法**

研究使用雄性Long-Evans大鼠（购自台湾国家生物模型中心，National Center for Biomodels，NCB），共55只，两个实验合计10只纳入最终分析。采用双荧光逆行示踪技术，以自组装玻璃微电极配合Hamilton注射器将CTB-AF488与CTB-AF594按立体定位坐标单侧注射至pPVT与PRC（实验1）或pPVT与periRE（实验2），追踪10–14天后灌注取材、冰冻切片。以荧光显微镜采集图像，手动计数PL、IL、dCA1、vCA1、dSub和vSub各取样层面的单/双标记神经元，并以三因素重复测量方差分析（RM ANOVA）及Tukey HSD事后检验比较细胞密度（# cells/mm²），报告偏eta平方（??²_p）作为效应量。

**研究结果**

实验1：mPFC和HPC向pPVT和/或PRC投射的分析。经组织学核查，27只中22只被排除，最终纳入5只（#14、#15、#23、#24、#26）。向pPVT投射的神经元标记为绿色，向PRC投射的标记为红色，同时投射至两者的侧支投射神经元双标记为黄色。

mPFC的投射。PL的投射：在PL四个层面（不分层）检查细胞群体差异，发现"Target"主效应显著，事后比较显示向pPVT的投射强于向PRC，未见PL向pPVT和PRC的侧支投射。按层次分析（四层合并）发现"Target"与"Layer"主效应显著及二者交互作用显著，深层和浅层均显示向pPVT投射强于PRC，且向pPVT的投射在深层强于浅层，而向PRC的投射在两层间无差异。总体上，PL向pPVT的投射强于向PRC，多数投射起源于深层，半球间无偏侧化，无侧支投射。IL的投射：在IL四个层面发现"Target"与"Level"主效应显著及二者交互作用显著，事后比较显示在+3.24 mm和+2.76 mm处向pPVT的投射强于PRC，无侧支投射。按层次分析发现"Target"与"Layer"主效应及交互作用显著，深层向pPVT投射强于PRC，浅层向两者的投射幅度相当；向pPVT的投射深层强于浅层，向PRC则无层间差异。总体上，IL向pPVT投射强于PRC，多数起源于深层，半球间无偏侧化，无侧支投射。

HPC的投射。dCA1和vCA1的投射：dCA1四个层面各主效应及交互作用均无统计学差异，总体上dCA1向pPVT或PRC的投射相当，半球间无偏侧化，标记神经元细胞密度普遍较低。vCA1四个层面发现"Target"与"Direction"主效应显著、"Level"主效应边缘显著，多种交互作用显著或边缘显著。同侧投射的事后比较显示向PRC投射强于pPVT及稀疏的侧支投射，后两者间无差异；对侧投射中各目标间无差异。vCA1向PRC的投射同侧强于对侧，而向pPVT的投射无偏侧化；在?5.28 mm、?5.52 mm和?5.88 mm层面，向PRC投射强于pPVT，且在全部四个层面均强于稀疏侧支投射。总体上，vCA1向PRC投射强于pPVT且来自同侧，侧支投射稀疏，五只大鼠双标记/单标记细胞比值平均为1.65%（范围0.00%–5.08%）。dSub和vSub的投射：dSub四个层面发现"Target"与"Direction"主效应显著，"Level"主效应边缘显著，"Target"与"Direction"交互作用显著。同侧投射中向PRC强于pPVT和稀疏侧支投射；对侧投射中各目标间无差异；dSub向PRC投射同侧强于对侧，向pPVT无偏侧化。总体上dSub向PRC投射强于pPVT且来自同侧，侧支投射稀疏，双/单标记比值为2.00%（范围0.00%–8.25%）。vSub四个层面发现"Target"与"Direction"主效应显著及二者交互作用显著，同侧和对侧投射均显示向pPVT强于PRC和稀疏侧支投射；vSub向pPVT投射同侧强于对侧，向PRC无偏侧化。总体上vSub向pPVT投射强于PRC且来自同侧，侧支投射几乎为零，双/单标记比值为0.56%（范围0.00%–1.26%）。

实验2：mPFC和HPC向pPVT和/或periRE投射的分析。经组织学核查，28只中23只被排除，最终纳入5只（#9、#12、#13、#16、#21）。向pPVT投射的神经元标记为绿色，向periRE投射的标记为红色，侧支投射神经元双标记为黄色。

mPFC的投射。PL的投射：四个层面发现"Target"与"Direction"主效应显著及二者交互作用显著，事后比较显示向periRE投射强于pPVT，二者均强于稀疏侧支投射；向periRE或pPVT的投射同侧强于对侧，侧支投射无半球差异。按层次分析发现各主效应及多种交互作用显著，同侧和对侧深层均显示向periRE强于pPVT且均强于侧支投射；浅层向periRE或pPVT的投射幅度相当但均强于侧支投射；PL向periRE或pPVT的投射多数局限于深层；无论同侧或对侧，深层投射均强于浅层。总体上PL向periRE投射强于pPVT，多数源于深层，半球间存在偏侧化，侧支投射几乎为零，双/单标记比值平均0.65%（范围0.14%–1.28%）。IL的投射：四个层面发现"Target"与"Direction"主效应显著，"Target"与"Direction"、"Target"与"Level"交互作用显著。同侧投射中向periRE强于pPVT且均强于稀疏侧支投射；对侧投射中向periRE或pPVT幅度相当但均强于侧支投射；向periRE的投射同侧强于对侧，向pPVT及侧支投射无偏侧化；在+3.72 mm处向periRE强于pPVT，在全部四个层面均强于侧支投射。按层次分析发现各主效应及多种交互作用显著，同侧深层向periRE强于pPVT且均强于侧支投射，对侧深层向两者幅度相当但均强于侧支投射；浅层向periRE或pPVT幅度相当，向periRE强于侧支投射；多数投射局限于深层；深层中向periRE的同侧投射更强，浅层中向periRE的对侧投射更强，向pPVT及侧支投射无半球差异。总体上IL向periRE投射强于pPVT且多源于深层，偏侧化仅见于periRE，侧支投射几乎为零，双/单标记比值平均0.30%（范围0.00%–0.44%）。

HPC的投射。dCA1和vCA1的投射：dCA1四个层面仅"Target"主效应边缘显著，其余无统计学差异，总体上dCA1向periRE或pPVT投射相当，无偏侧化，侧支投射稀疏，双/单标记比值平均3.00%（范围0.21%–9.07%）。vCA1四个层面发现"Target"与"Level"主效应显著，事后比较显示向periRE或pPVT的投射幅度相当，但均强于稀疏侧支投射。总体上vCA1向periRE或pPVT投射相当，无偏侧化，侧支投射稀疏，双/单标记比值平均1.41%（范围0.21%–4.24%）。dSub和vSub的投射：dSub四个层面发现"Target"与"Level"主效应显著及二者交互作用显著，事后比较显示在全部四个层面向periRE的投射强于pPVT和稀疏侧支投射，后两者间无差异。总体上dSub向periRE投射强于pPVT，无偏侧化，侧支投射几乎为零，双/单标记比值平均0.21%（范围0.00%–0.53%）。vSub四个层面发现"Target"、"Direction"与"Level"主效应显著，"Target"与"Level"交互作用及三因素交互作用显著。同侧投射中四个层面向periRE或pPVT幅度相当，向periRE在全部四层强于侧支投射，向pPVT在?5.88 mm和?6.12 mm处强于侧支投射；对侧投射中在?5.88 mm、?6.12 mm和?6.24 mm处向periRE强于pPVT，向periRE在全部四层、向pPVT在?5.88 mm和?6.24 mm处强于侧支投射；在?6.24 mm处向periRE的同侧投射强于对侧，在?6.12 mm处向pPVT的同侧投射强于对侧，侧支投射无层面间差异。总体上vSub向periRE投射强于pPVT，偏侧化较微弱，可能归因于vSub向对侧pPVT的投射略弱，侧支投射几乎为零，双/单标记比值平均0.13%（范围0.00%–0.28%）。

**讨论与结论**

讨论部分指出，研究采用双荧光逆行示踪方法检查了mPFC（PL和IL）和HPC（dCA1、vCA1、dSub和vSub）向pPVT和PRC（实验1）以及向pPVT和periRE（实验2）的投射分布与侧支化情况。综合两个实验的主要发现：实验1中，mPFC来自PL和IL深层的投射优先靶向pPVT，向pPVT或PRC的投射均无偏侧化；HPC中vCA1和dSub向PRC的投射以及vSub向pPVT的投射主要来自同侧。实验2中，PL深层投射优先靶向periRE，向同侧periRE和pPVT的投射占优势；IL向periRE或pPVT的投射均源于深层，向同侧periRE的投射占优势而向pPVT无偏侧化；HPC向periRE或pPVT的投射总体无偏侧化，dSub优先靶向periRE。两个实验所有检查区域中仅见稀疏的侧支投射神经元。

作者分析了两实验间的不一致，认为可能归因于示踪剂覆盖范围及在pPVT内定位的差异：实验1中pPVT内平均荧光覆盖率为39.44% ± 15.62%（范围24.70%–65.76%），实验2达47.46% ± 17.64%（范围24.27%–70.23%），实验2较大的有效摄取面积可能解释其采样到更多向pPVT投射的神经元；实验1中示踪剂在pPVT内的扩散位置较实验2偏内侧，这种定位差异可能导致实验2观察到而实验1未观察到的PL向pPVT投射的偏侧化。作者还指出，既往研究报道投射至外侧内嗅皮层（lateral entorhinal cortex，LEC）/PRC的神经元主要见于mPFC浅层，而本实验1中来自PL和IL浅层的投射神经元相对较少，可能源于本研究中示踪剂在PRC内的分布主要位于深层而非浅层。作者也注意到示踪剂荧光超出注射位点，实验2中明显溢至RE内periRE内侧区域及pPVT背侧区域；由于内侧缰核（medial habenula，MHb）主要接受隔区投射，所观察到的mPFC和HPC逆行标记神经元代表向pPVT的输入，但RE与periRE均接受PL和IL投射且RE接受vCA1、dSub和vSub输入，因此不能排除部分采样神经元支配RE的可能性。

与既往研究（Schlecht et al. 2022）比较，两项研究一致显示多数periRE投射神经元局限于PL和IL深层，且均未观察到mPFC神经元同时侧支投射至丘脑靶点和LEC/PRC，提示丘脑与皮层中继环路在介导mPFC输出中的不同作用。在dCA1和vCA1方面，Schlecht等仅取样?6.12 mm层面，报道少数dCA1神经元投射至腹侧中线丘脑（ventral midline thalamus，vmThal）而无vCA1向vmThal的投射，dCA1和vCA1均投射至PRC/LEC；本研究中dCA1和vCA1均向periRE发出投射，但多数PRC投射神经元见于同侧vCA1，与之不同；作者指出Schlecht等将示踪剂局限于PRC与扩散至LEC的病例分组分析，发现dCA1和vCA1向同时包含LEC和PRC区域的投射强于仅局限于PRC的区域。在dSub和vSub方面，Schlecht等发现多数vmThal投射细胞见于dSub，而多数LEC/PRC投射细胞及双投射细胞来自vSub；本研究观察到dSub和vSub均投射至periRE且dSub投射更强，但实验1中dSub向PRC的投射强于vSub向PRC的投射，且仅见稀疏侧支投射。作者认为与Schlecht等结果的差异可能源于所分析海马亚区及示踪剂注射位置的差异。与既往报道vSub向RE发出强投射的研究（McKenna and Vertes 2004）不同，本研究显示dSub向periRE的投射强于vSub，差异可能归因于注射位点（主要靶向periRE或RE）或示踪剂扩散范围的不同。

作者进一步指出，mPFC中多数periRE投射或pPVT投射神经元见于PL和IL的同侧；与这些丘脑投射相比，向PRC的皮层投射相对较弱；PL与IL之间存在同侧和对侧相互投射并形成前额叶功能的内在环路，因此提示periRE和pPVT作为mPFC信息整合通路的丘脑输出。HPC中多数PRC投射神经元见于同侧vCA1和dSub，多数pPVT投射神经元见于同侧vSub，periRE接受dSub相对强的无偏侧化输入；dHPC内dCA1与dSub形成同侧相互连接并投射至对侧dCA1和dSub，vHPC内vCA1向vSub发出同侧投射，因此vCA1、dSub和vSub输出神经元的分离反映了HPC与皮层或丘脑靶区通讯的平行通路。

作者承认本研究存在局限：第一，未进行DAPI等核染色，限制了区分真实细胞荧光与非特异性背景信号的能力，仅基于荧光通道信号进行细胞定量可能导致假阳性；第二，细胞计数在感兴趣脑区的选定区域而非整个结构上进行，PL的第I层因标记神经元稀少而未纳入分析，HPC中检查了dCA1和vCA1的近端与远端亚区而仅分析近端dSub和远端vSub，这种取样方式虽减少处理时间与计算需求，但可能忽略细胞分布的空间异质性并导致取样偏倚，未来结合核染色提高细胞分割精度并采用全区域分析将能更好地重建通路。

研究结论（译文）：综上，研究人员考察了mPFC和HPC各亚区向丘脑中继结构periRE和pPVT以及向皮层中继结构PRC的投射。多项研究已证明periRE、pPVT和PRC在不同任务中调控mPFC与HPC之间的相互作用。本研究结果刻画了mPFC-HPC网络内丘脑与皮层中继结构的不同解剖学连接，可为认知与情绪功能背后的环路机制提供关键见解。