《Virchows Archiv》：DNA methylation analysis in urinary samples is associated with recurrence and grade progression in selected patients with pT1 low-grade urothelial bladder carcinoma
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低级别尿路上皮癌（low-grade urothelial carcinoma, LGUC）相较于高级别尿路上皮癌（high-grade urothelial carcinoma, HGUC）具有较低的复发及分级进展风险，但部分患者仍可能出现复发和/或分级进展
低级别尿路上皮癌（low-grade urothelial carcinoma, LGUC）相较于高级别尿路上皮癌（high-grade urothelial carcinoma, HGUC）具有较低的复发及分级进展风险，但部分患者仍可能出现复发和/或分级进展。Bladder EpiCheck检测（Nucleix Ltd）分析15个DNA甲基化生物标志物，并提供一个名为EpiScore的评分。在本回顾性研究中，研究人员对78例随后获得LGUC组织学诊断的患者进行了尿液细胞学检查及尿液甲基化分析。患者在接受治疗后，每6个月通过膀胱镜检查及排尿尿液细胞学检查进行随访，随访时间为1至2年。随访期间，78例患者中的31例（40%）出现复发，其中7例进展为HGUC。78例患者中的47例（60%）未观察到复发。在初次诊断时，EpiScore≥60与复发肿瘤相关（p＜0.0001）。进展为HGUC仅见于EpiScore≥60的患者，但由于进展事件数量有限且EpiScore＜60组无事件发生，该结果应谨慎解读。总之，尿液甲基化分析可能识别出LGUC患者中与复发及向HGUC分级进展相关的亚组。这些发现属于探索性结果，有待在更大规模、更具异质性的队列中进行前瞻性验证。
**研究背景与问题**
尿路上皮膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder carcinoma, NMIBC）是其最常见的表现形式，涵盖Ta、T1期肿瘤及原位癌（carcinoma in situ, CIS）。根据ISUP分类系统，乳头状尿路上皮肿瘤被分为乳头状瘤、低度恶性潜能乳头状尿路上皮肿瘤、低级别尿路上皮癌（low-grade urothelial carcinoma, LGUC）和高级别尿路上皮癌（high-grade urothelial carcinoma, HGUC）。LGUC在经尿道膀胱肿瘤切除术（transurethral resection of bladder tumor, TURB）后具有较低的复发风险，但部分患者仍可能出现分级和/或分期进展。尽管已有大量研究探索临床病理因素与疾病预后的关联，但目前仍缺乏经过前瞻性验证的分子标志物来有效区分LGUC中具有进展风险的亚组。DNA甲基化是肿瘤进展的重要表观遗传机制，在尿路上皮肿瘤中已被证实与疾病进展相关。Bladder EpiCheck检测（BE, Nucleix Ltd）通过分析15个DNA甲基化生物标志物，得出介于0至100之间的EpiScore评分，以≥60为阳性阈值，提示HGUC高风险。该检测在NMIBC的诊断和监测中已有较多研究，但其在LGUC中的表现及预后价值尚不明确。现有证据表明BE检测对低级别肿瘤的敏感性低于高级别肿瘤，且其在LGUC患者中对复发和分级进展的预测能力缺乏专门研究。基于上述背景，研究人员开展了一项回顾性研究，旨在探索尿液DNA甲基化分析在选择性pT1 LGUC患者中与复发及向HGUC分级进展的相关性。
**研究设计与技术方法**
研究人员回顾性纳入了2020年1月至2023年11月期间因首次血尿就诊的78例患者，所有患者经组织学确诊为pT1期LGUC。队列平均年龄72.5岁（范围45至93岁），男性47例，女性31例。所有肿瘤均为单发、直径＜3 cm的乳头状外生性病变。患者接受TURB及术后单次化疗药物膀胱灌注，随后每6个月通过膀胱镜和排尿尿液细胞学进行随访，随访时间为1至2年。尿液样本在首次诊断时同时进行液基细胞学检查（ThinPrep TP 5000系统）和Bladder EpiCheck甲基化分析（Nucleix Ltd）。细胞学诊断依据巴黎系统（The Paris System）进行分类，由两位专家尿病理医师独立审阅，意见不一致时由第三位专家裁定。BE检测采用甲基化敏感性限制性内切酶消化基因组DNA，经PCR扩增后由BE软件计算EpiScore，以≥60为阳性阈值。组织学分级依据WHO 2004/2016系统，同时参照WHO 1973三级分类法。所有切片由两位专家尿病理医师（FP和MM）复阅，无法达成共识时由第三位（EDR）裁定。统计分析采用MedCalc 12.3.0和GraphPad Prism 5软件，分类变量比较采用卡方检验或Fisher精确检验，Kaplan-Meier曲线比较采用log-rank检验，并建立了探索性Cox比例风险回归模型。
**研究结果**
*BE检测与细胞学和组织学诊断的分布*：在78例患者中，40例（51%）细胞学诊断为阴性（NHGUC），30例（38.5%）为非典型尿路上皮细胞（AUC），8例（11%）为HGUC阳性。组织学诊断均为pT1期LGUC，其中5例（6%）为WHO 1973 G1，73例（94%）为G2。BE检测显示，47例（60%）EpiScore≥60，其中细胞学诊断为HGUC者7例、AUC者20例、NHGUC者20例；31例（40%）EpiScore＜60，其中AUC者11例、NHGUC者20例。阳性BE结果分布在包括NHGUC在内的不同细胞学类别中，提示甲基化分析与尿液细胞学提供部分重叠但非完全相同的信息。
*EpiScore与肿瘤复发的关系*：随访期间，78例患者中31例（40%）出现经组织学证实的复发，其中24例为低级别复发（3例G1pT1，21例G2pT1），7例进展为HGUC（G3pT1）。47例（60%）未出现复发。统计分析显示，EpiScore≥60与复发显著相关（p＜0.0001；OR 23.36，95% CI 4.96至109.94）。在47例EpiScore≥60的患者中，29例出现复发；而在31例EpiScore＜60的患者中，仅2例复发。EpiScore≥60还与年龄显著相关（p=0.034，OR 0.35，95% CI 0.14至0.9）。Kaplan-Meier曲线显示了BE状态与无复发生存之间的分离趋势。探索性Cox回归分析纳入了BE和吸烟状态两个候选变量，结果显示仅BE结果与复发显著相关（β=3.1455；SE=0.7996；Wald=15.4773；p=0.0001），对应的风险比（hazard ratio, HR）为23.2321（95% CI: 4.8473至111.3479）。由于本队列所有肿瘤均为单发且＜3 cm，肿瘤大小和多发性无法纳入多因素调整。
*EpiScore与分级进展的关系*：进展为HGUC仅在BE阳性组中观察到，47例EpiScore≥60的患者中有7例进展为HGUC，而31例EpiScore＜60的患者中无进展事件发生。由于EpiScore＜60组无事件发生，常规比值比（odds ratio, OR）无法可靠估计，该结果仅作描述性报告。在复发亚组中，进展同样仅见于EpiScore≥60的患者（7/29 vs. 0/2），但因EpiScore＜60组复发例数极少，无法进行有效的统计推断。探索性Kaplan-Meier曲线显示进展仅发生于BE阳性患者，但由于事件数有限，该曲线仅作为描述性可视化，而非确定性的时间-事件比较。
**讨论与结论**
本研究发现，在选择性pT1 LGUC患者中，超过50%的患者BE检测阳性，EpiScore≥60与1至2年随访期间的肿瘤复发显著相关，且分级进展为HGUC仅见于BE阳性患者。BE检测对LGUC的敏感性低于HGUC，这与既往文献报道一致。EpiScore≥60在不同细胞学类别（包括NHGUC、AUC和HGUC）中均有分布，提示DNA甲基化分析可能检测到并非必然伴随高级别细胞学形态的DNA甲基化风险特征，两种检测方法可能具有互补性。该发现与肿瘤异质性及不同尿祖细胞具有不同分子特征的假说相符，LGUC中可能存在与复发及向HGUC进展相关的独特DNA甲基化分子特征。同时，研究强调国际指南对不同NMIBC风险分层的标准存在差异，本队列属于选择性pT1低级别中间风险人群，但不等同于所有EAU定义的中间风险群体。该研究存在多项局限性：回顾性设计可能引入选择偏倚；单中心小样本队列限制结果的可靠性；队列仅包含单发、＜3 cm的pT1 LGUC肿瘤，研究结果不宜推广至更广泛的中间风险NMIBC患者；肿瘤大小和多发性因队列内无变异而无法纳入多因素模型；1至2年的随访时间相对较短，无法捕捉超过2年的晚期复发和进展；TURB标本存在观察者间变异和采样局限性。综上，尿液甲基化水平可能作为LGUC中一个与复发和分级进展相关的分子特征，但应视为探索性和假设生成性的发现。更大规模、更长随访、预设终点且依据明确的国际指南标准进行风险分组的前瞻性研究，是确定Bladder EpiCheck是否可用于该临床背景风险分层的必要条件。研究结论为：尿液DNA甲基化分析（Bladder EpiCheck）所评估的阳性甲基化谱可能与选择性pT1 LGUC患者的复发及向HGUC分级进展相关，但这些发现应视为探索性结果，尚不能支持该检测作为独立工具指导治疗选择或调整监测策略，需进一步的前瞻性验证才能确定其临床应用价值。
