《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：Non-canonical caspase-8 activation by cathepsin B drives anti-inflammatory human macrophage polarization
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抗炎单核细胞来源的巨噬细胞对维持组织稳态至关重要，但也可促进疾病进展，特别是在癌症和纤维化中。因此，解析调控其生成的信号通路可能为开发新的治疗策略提供契机。研究人员在此揭示了一个先前未被认识的caspase-8（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8）非凋亡功能，该功能既可
抗炎单核细胞来源的巨噬细胞对维持组织稳态至关重要，但也可促进疾病进展，特别是在癌症和纤维化中。因此，解析调控其生成的信号通路可能为开发新的治疗策略提供契机。研究人员在此揭示了一个先前未被认识的caspase-8（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8）非凋亡功能，该功能既可驱动单核细胞向巨噬细胞分化，也可驱动抗炎巨噬细胞极化。研究人员鉴定出组织蛋白酶B（Cathepsin B, CTSB）是caspase-8的新型上游激活因子，其通过非经典切割机制发挥作用，赋予caspase-8一种区别于其凋亡角色的独特活性特征。无论是基因水平还是药理学水平阻断CTSB-caspase-8轴，不仅会损害抗炎巨噬细胞的生成，还会将其重编程为促炎表型。研究人员的发现确立了CTSB-caspase-8轴是巨噬细胞命运决定中的一个原创性关键调控节点，并使其成为癌症、炎症及纤维化疾病中人类巨噬细胞治疗性重编程的一个极具前景的靶点。
巨噬细胞作为先天免疫系统的核心效应细胞，具有高度可塑性，在肿瘤、炎症及纤维化等疾病进程中常发挥促进病理进展的作用。既往研究已明确半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）家族是细胞稳态与调节性细胞死亡（regulated cell death, RCD）的关键调控者，其中caspase-8在经典通路中介导外源性凋亡。然而，近年发现在单核细胞向巨噬细胞分化及抗炎极化过程中存在持续的非凋亡caspase激活，涉及caspase-8、caspase-3及caspase-7。尽管该现象已被观察到，但以下问题长期悬而未决：何种上游蛋白酶能在不触发细胞死亡的前提下激活caspase-8；非经典切割产生的片段是否具备独特的生化特性；这些信号如何偶联至巨噬细胞命运决定；以及该通路在极化重编程中的可逆性如何。此外，经典抗炎极化通路中的STAT6激活无法充分解释建立M2样巨噬细胞身份所需的蛋白水解与代谢重塑。基于上述科学空白，研究人员以原代人单核细胞来源巨噬细胞为模型，旨在揭示非凋亡caspase激活的分子开关及其治疗学价值。
该研究发表于《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》。研究人员系统阐明了组织蛋白酶B（Cathepsin B, CTSB）通过非经典切割机制激活caspase-8的上游信号，证实该CTSB-caspase-8轴选择性调控单核细胞向巨噬细胞的分化及IL-4等诱导的抗炎极化。研究进一步证实，无论是药理学抑制还是基因沉默，阻断该轴均可将已建立的M2样巨噬细胞重编程为促炎、糖酵解且功能活跃的状态。这些发现将CTSB-caspase-8轴确立为巨噬细胞命运决定中的关键检查点，并为癌症、炎症及纤维化疾病中定向重编程人巨噬细胞提供了新的理论依据与干预靶点。
本研究以法国血库（Etablissement Fran?ais du Sang, EFS, n°13-PP-11）健康供者外周血为来源，每例混合至少两名供者的外周血单个核细胞（PBMCs）作为一个生物学重复。研究人员采用CD14微珠阳性分选获得原代人单核细胞，以50 ng/mL CSF-1（集落刺激因子1）诱导分化为M0巨噬细胞，进而以脂多糖（LPS）联合干扰素-γ（IFN-γ）或白细胞介素-4（IL-4）分别诱导促炎（M1）或抗炎（M2）极化。主要关键技术方法包括：利用免疫印迹检测caspase-8、caspase-7、caspase-3及其底物p47 Phox、Lyn的切割片段；建立基于荧光底物Ac-NKFD-AMC和Ac-KWFD-AMC的非凋亡caspase活性检测体系，并与Ac-RR-AMC（检测CTSB）、Ac-IETD-AMC（检测caspase-8）、Ac-DEVD-AMC（检测caspase-3）及Ac-WEHD-AMC（检测caspase-1）等标准底物进行区分；采用siRNA或shRNA沉默CASP8、CTSB、CASP7、CASP3等基因，结合流式细胞术检测CD200R、CD209、CD86、CD163等表面标志物；通过亚细胞分级分离及密度梯度超速离心获得微粒体及线粒体、溶酶体等细胞器富集组分，结合免疫荧光与Pearson相关系数分析评估切割型caspase-3与TOM20或LAMP2的共定位；最后进行全转录组RNA测序（RNA-sequencing），经质控、比对、定量后，采用DESeq2进行差异表达分析，并用clusterProfiler进行基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析。
在"Non-apoptotic caspases are activated during monocyte-to-macrophage differentiation and anti-inflammatory macrophage polarization"部分，研究人员发现CSF-1诱导的单核细胞向巨噬细胞分化及IL-4诱导的抗炎极化伴随caspase-8、caspase-7、caspase-3及底物p47 Phox和Lyn的非经典切割，产生34、30、26、40和51 kDa等特征性片段；该模式在使用Venetoclax诱导的经典凋亡性切割中完全不存在。非经典切割在M2巨噬细胞中持续存在，但在M1巨噬细胞中完全消失，且该过程具有可逆性：IL-4可重新诱导该活性，而LPS联合IFN-γ则终止其活性。基于蛋白质组学揭示的NxxD或KxxD非经典切割基序，研究人员开发的Ac-NKFD-AMC和Ac-KWFD-AMC底物可在分化和M2细胞中特异性检测非凋亡caspase活性，而重组caspase-8、caspase-3或caspase-1不能切割这些底物，证实了该活性检测的特异性。
在"Non-apoptotic caspase-7 and caspase-3 cleavages rely on a cathepsin B dependent- non-apoptotic caspase-8 activation, during monocyte-to-macrophage differentiation and anti-inflammatory macrophages polarization"部分，研究人员证实caspase-8的非经典切割不依赖于caspase酶活性。使用Bafilomycin A1抑制溶酶体酸化后，非凋亡caspase片段生成显著受抑。siRNA筛选显示，CTSB沉默选择性抑制非凋亡caspase活性及caspase-8、-7、-3片段生成，而CTSD、CTSL或CTSS沉默效果有限。药理学抑制CTSB（CA-074-Me）同样阻断非经典切割，并损害巨噬细胞分化标志物CD163和CD16的表达。体外生化实验表明，活性CTSB可直接切割重组caspase-8产生与细胞内观察到的相同的34 kDa片段，而CTSB单独不能切割NKFD或KWFD底物，确认了切割的特异性由caspase执行。
在"Non-apoptotic caspases fragments are specifically located in the mitochondrial compartment in unpolarized and anti-inflammatory macrophages"部分，亚细胞分级分离显示非凋亡caspase片段主要富集于微粒体组分，并在内质网与线粒体富集组分（F3）中检测到非经典caspase活性。免疫荧光进一步证实，非凋亡切割形式的caspase-3在M0和M2巨噬细胞中特异性定位于线粒体，与线粒体外膜标志物TOM20显著共定位，而不与溶酶体标志物LAMP2共定位。
在"Pharmacological inhibition of CTSB or caspases in unpolarized macrophages prevents anti-inflammatory macrophages generation"部分，研究人员发现于第4天加入CTSB抑制剂CA-074-Me或泛caspase抑制剂Emricasan处理，可显著降低IL-4诱导后抗炎标志物CD200R和CD209的表面表达，并下调趋化因子CCL17和CCL18的转录水平，表明阻断上游通路足以阻止抗炎巨噬细胞的获得。
在"Pharmacological inhibition of CTSB and caspases in anti-inflammatory macrophages trigger phenotypical and functional reprogramming towards pro-inflammatory macrophages"部分，对已建立的M2巨噬细胞进行进一步药理学抑制，CTSB或caspase抑制均降低CD200R和CD209表达，并减少CCL18、CCL13和CCL23分泌。Emricasan处理还特异性上调促炎标志物CD86、细胞因子IL-1α、趋化因子CCL20及TNF-α的分泌。功能上，该处理降低M2巨噬细胞对E. coli包被beads的吞噬能力，却增强其对白血病细胞的吞噬作用，并伴随活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生增加与糖酵解代谢重塑；重要的是，该干预对已建立的M1极化无明显影响。
在"Genetic inhibition of CTSB or caspase-8 reprograms anti-inflammatory macrophages into pro-inflammatory macrophages"部分，siRNA沉默CTSB、CASP8、CASP7或CASP3同样降低CD200R和CD209表达；其中CASP8沉默特异性上调CD86、IL-1α和CCL20，并增加TNF-α和CCL20分泌。shRNA沉默CASP8可重现表型并降低抗E. coli吞噬能力、增加ROS产生。与药理学结果一致，遗传学抑制同样不影响M1极化状态。
在"Genetic inhibition of CTSB or caspase-8 induces a Transcriptomic reprogramming of anti-inflammatory macrophages"部分，CASP8沉默显著改变3211个基因的表达（上调1615个，下调1596个）。GO分析显示"cytokine反应"、"bacterium反应"、"inflammatory response"和"leukocyte activation"等促炎通路被显著激活，抗炎趋化因子CCL23、CCL24下调，促炎趋化因子CCL4、CCL7上调。CTSB沉默虽仅影响218个基因，但同样显著富集于"cytokine反应"和"inflammatory response"类别，证实该轴对转录组的广泛调控。
在讨论中，研究人员指出CTSB依赖的非经典caspase-8级联是调控人巨噬细胞分化和抗炎极化的全新机制。非经典caspase片段定位于内质网/线粒体区室而非弥散胞质，这种区室化可能有助于接近特定底物并阻止向凋亡执行进展。尽管研究证实CTSB位于该级联顶端，其上游调控机制（如自噬、翻译后修饰）及caspase-3、caspase-7的特异性底物谱仍有待进一步阐明。此外，CA-074-Me与Emricasan虽然均导致抗炎身份丧失，但在特定炎症输出上的差异反映了CTSB上游抑制与直接caspase抑制在溶酶体功能及底物选择性上的不同。研究强调，caspase抑制并未全局损害巨噬细胞功能，而是特异性地将抗炎巨噬细胞重定向至更具炎症性和抗白血病的状态。
基于上述发现，研究人员总结认为，CTSB-caspase-8非经典轴不仅是M2样巨噬细胞身份的标志物，更是可被利用的功能脆弱性。药理学与遗传学抑制该通路可削弱抗炎特征并诱导促炎转变，其中caspase-8抑制产生最强的重编程效应。caspase抑制并不全局改变巨噬细胞功能，而是将抗炎巨噬细胞效应功能重定向至更具炎症性和抗白血病状态。这些数据为治疗性再教育癌症中有害的抗炎巨噬细胞提供了理论依据。未来开发以KxxD/NxxD切割基序为引导、选择性靶向非凋亡caspase活性的抑制剂，将是该领域的重要方向。
