基于产水解酶高性能重组酵母的整合生物加工关键影响因素研究

《BioEnergy Research》：Influence of Key Factors on Hydrolytic Enzyme Production by High Performance Recombinant Yeast for Consolidated Bioprocessing

　　

整合生物加工（Consolidated Bioprocessing, CBP）是一种用于集成生物炼制的有前景的技术，其中酶生产、生物质水解以及C5和C6糖发酵为第二代乙醇（2G ethanol）或其他生物产品被整合到单一生物反应器中。然而，开发一种高度适合CBP的微生物，使其能够高效分泌酶并同时发酵所有释放的糖，仍然是一个挑战。此外，选择工艺条件以增强酶生产并 consequently 提高生物质转化率具有重要意义。在本研究中，考察了关键工艺条件对酵母Saccharomyces cerevisiae AC14（七种水解酶的生产者）生产水解酶和2G乙醇的影响，旨在将其应用于CBP。在评估发酵培养基组成、pH和氧气供应时，使用含有单体和聚合物混合物的发酵培养基、pH 5.5和厌氧条件，获得了每干细胞重量（dcw）酶活性的最佳结果（总纤维素酶2.13 IU.g^?1dcw、木聚糖酶102.0 U.g^?1dcw、β-葡萄糖苷酶7.38 U.g^?1dcw和β-木糖苷酶25.5 U.g^?1dcw）、乙醇产率（90.3%）和乙醇生产率（1.0 g.L^?1.h^?1）。最重要的是，发现木聚糖的存在对纤维素酶分泌至关重要。在最适条件下，进行了带细胞回收的重复分批培养，达到10个循环且底物完全转化。因此，所获得的关于CBP的新知识有助于增强其在集成生物炼制背景下的潜在应用。

**研究背景与问题提出**

木质纤维素生物质被视为开发可持续过程最可预见的原料，旨在将可再生过程纳入全球能源矩阵，以减少环境影响和温室气体排放。当前大多数运营的甘蔗基生物炼制厂联产第一代（1G）乙醇、糖和能源，同时在甘蔗加工后产生大量木质纤维素甘蔗衍生物（甘蔗渣和秸秆）。在此背景下，第二代（2G）乙醇是自然可纳入这些工厂的生物燃料，因为集成的1G/2G乙醇过程可以潜在提高工厂可行性和生物过程经济性。木质纤维素生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，此外还有少量蛋白质、矿物质等。生物质在2G工厂中的广泛使用取决于可持续且成本有效的技术来克服顽固的生物质结构。经过预处理步骤后，生物质中的纤维素和半纤维素可以分别解聚为主要葡萄糖和木糖。然而，所需酶混合物的高成本是生物炼制开发中的主要挑战之一。

因此，生物质的整合生物加工（Consolidated Bioprocessing, CBP）是一种新兴技术，其特征是在同一生物反应器中同时生产水解酶、水解木质纤维素材料以及发酵C5和C6糖（通常为2G乙醇）。该策略具有操作简单、无需外源酶混合物、降低污染风险以及利用生物质释放的戊糖和己糖等优点。此外，由于可发酵糖被微生物立即消耗，避免了渗透胁迫和水解酶的反馈抑制。考虑到缺乏已知的高性能天然微生物能够在木质纤维素水解产物抑制剂和高乙醇浓度存在下高效表达酶并消耗C6和C5糖，许多研究集中于开发能够在CBP期间执行这些功能的工程菌株。然而，文献报道了低乙醇滴度和长发酵时间及低乙醇生产率的问题。在此背景下，由Claes等人开发的酵母Saccharomyces cerevisiae AC14脱颖而出，能够分泌七种水解酶（内切葡聚糖酶EC 3.2.1.4、β-葡萄糖苷酶EC 3.2.1.21、纤维二糖水解酶I和II EC 3.2.1.91、木聚糖酶EC 3.2.1.8、β-木糖苷酶EC 3.2.1.37和乙酰木聚糖酯酶EC 3.1.1.72），并能高效发酵木糖。使用CRISPR/Cas9方案将异源基因整合到该菌株基因组中，以插入分泌纤维素水解酶和半纤维素水解酶的能力。此外，该菌株构建自工业酵母Ethanol Red，使其比其他文献报道的重组酵母具有更强的鲁棒性。Perez等人使用AC14酵母在CBP中取得了有希望的结果，然而，为建立稳健且可扩展的过程，必须评估关键工艺条件对CBP期间水解酶生产的影响，因为该过程涉及复杂的反应链，包括酶的原位生产和酶水解，这实际上是木质纤维素生物质整体转化为乙醇的限速步骤。然而，迄今为止文献中对此问题探索不多。尽管AC14是使用强组成型启动子开发的，但发酵培养基的组成和工艺参数（如pH和氧气供应）也可能是影响酶生产进而影响CBP的因素，因此对该菌株进行这些方面的表征非常重要。因此，本研究的目的是评估关键工艺条件对AC14酵母生产水解酶和2G乙醇的影响，旨在表征该菌株并确定其应用于CBP的重要因素（pH、氧气供应和培养基组成）。为实现此目的，采用了单因素实验方法。虽然单因素实验不允许建立研究因素与所需响应之间的相关性，但它非常适合新微生物的初步研究，因为它能够独立评估单个因素并便于确定合适的操作范围。这些初步结果为后续的多变量优化研究提供了基础。最后，选择最适条件并应用于重复分批培养，评估菌株的再现性和鲁棒性，并模拟工业乙醇生产过程（细胞被回收）。重复分批培养中CBP的性能在文献中探索较少，这为开发稳健且可扩展的生物炼制CBP过程提供了重要贡献。

**关键技术方法概述**

研究人员以S. cerevisiae AC14（通过CRISPR-Cas9方法顺序基因组整合七种异源基因编码七种木质纤维素水解酶的重组工业酵母）为研究对象，以亲本酵母S. cerevisiae MD4为阴性对照。在5 mL微型反应器（反应体积4 mL，配备CO₂出口）中进行发酵实验，通过频繁称重微型反应器估算CO₂损失来跟踪过程。测试了10种不同培养基组成（单体和聚合物化合物的不同组合），初始pH 5.5；随后评估初始pH（4.5、5.5、6.5）和氧气供应（好氧与厌氧）的影响。在选定条件下进行10次重复分批培养，每批结束时通过离心回收细胞并更换新鲜培养基。采用高效液相色谱（HPLC）定量乙醇、甘油、木糖醇、乙酸、木糖和葡萄糖浓度；通过总酸水解后HPLC定量残留可溶性寡聚物；测定总纤维素酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶活性；通过亚甲基蓝染色和Neubauer计数板评估酵母活力。使用Tukey检验（95%置信水平）进行统计比较。

**研究结果**

**培养基组成对CBP的影响**

通过比较AC14和MD4在10种不同培养基中的发酵性能，研究人员发现AC14和MD4在仅含葡萄糖或木糖的培养基1和2中表现相同，证实两种微生物均能高效消耗C5和C6糖，且AC14的遗传修饰未干扰这些糖的代谢。AC14能够水解并发酵培养基3、4和6（单体和多糖混合物）中的所有底物，达到总糖完全转化，而MD4仅同化单体部分（约50%转化）。AC14完全同化了基于多糖的培养基（5、7、8、9和10），证实了该菌株产生水解酶的能力，而MD4未消耗这些底物。AC14细胞活力在所有实验中保持在90%以上。在所有实验中乙醇产率约为理论值的90%，且不受碳源变化的影响。在含多糖和双糖的实验中产生了更高浓度的乙醇。本研究获得的最佳结果（约11 g.L^?1乙醇、90%理论产率、1 g.L^?1.h^?1生产率）与文献报道的CBP相比具有优势，这归因于AC14菌株的高水解能力。总糖转化在11小时内完成，满足了大规模CBP开发的主要要求。通过量化不同培养基中的酶活性，研究人员发现木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶的产生不受培养基组成影响，但总纤维素酶活性在仅含单体的培养基中非常低，而在含双糖和多糖的培养基中显著提高。通过测试仅含多糖的培养基（7、8、9和10），发现在仅含木聚糖的培养基9中观察到非常高的纤维素酶活性，与培养基3、4、5和6中测得的水平相当。由于木聚糖是这些培养基中唯一的共同组分，且所有含木聚糖的培养基均显示相似的高纤维素酶表达，研究人员得出结论：木聚糖是诱导纤维素酶活性的化合物。对木聚糖影响酶生产的进一步实验表明，木聚糖类型（玉米芯木聚糖与山毛榉木聚糖）不影响纤维素酶生产。基于上述结果，选择培养基6（含单体、双糖和多糖）用于进一步研究，其中产生了0.17 U.mL^?1（2.13 U.g^?1dcw）总纤维素酶、8.16 U.mL^?1（102.0 U.g^?1dcw）木聚糖酶、0.59 U.mL^?1（7.38 U.g^?1dcw）β-葡萄糖苷酶和2.04 U.mL^?1（25.5 U.g^?1dcw）β-木糖苷酶。

**初始pH的影响**

通过评估三种初始pH（4.5、5.5和6.5）下培养基6中的CBP，研究人员发现所有实验中总底物转化均达到。最高的乙醇浓度、生产率和产率在pH 5.5时观察到，表明这是CBP最有利的值。AC14产生的酶的最适pH范围为3.2至5.0。底物转化曲线显示在所有三种pH水平下总底物消耗均发生，但pH 4.5和6.5时乙醇产量较低，可能是较大比例的碳被导向细胞维持。最终木糖醇、甘油和乙酸浓度不显著。AC14最终活力在所有测试pH下保持在90%以上。最终酶活性测量表明，仅木聚糖酶生产受pH影响，pH 5.5有利于其生产。综合考虑pH 5.5有利于木聚糖酶生产并改善乙醇生产，选择初始pH 5.5继续研究。

**氧气供应的影响**

通过在pH 5.5和培养基6中研究发酵和好氧条件下的酶生产，研究人员发现除总纤维素酶外，好氧条件下酶活性更高，其中细胞生物质生产因氧气存在和代谢向TCA循环转移而得到促进。木聚糖酶、β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的生产似乎与细胞生长相关，可能因为这些基因克隆在组成型启动子下。先前结果显示厌氧条件下提供的前体供应足以支持CBP的酶合成，而厌氧条件下获得了令人满意的乙醇产率和产量。氧气供应研究证明了遗传构建策略与相应重组酵母工业应用之间的适宜性。如预期，虽然两种条件下均达到总底物转化，但好氧条件下乙醇浓度是发酵条件下的一半以下，导致较低的生产率。在氧气存在下，碳通量被导向生物质形成，以牺牲乙醇生产为代价，这也解释了最终细胞质量约15%的增加。细胞活力在两种条件下接近100%。

**重复分批CBP**

通过在选定条件下进行10次重复分批培养（每批11小时），研究人员发现所有循环中底物完全消耗。乙醇生产在所有批次中统计相似（约9.5 g.L^?1），表明酵母可连续复用十次。生产率和产率值几乎保持恒定。木糖醇、甘油和乙酸产量分别不超过0.6、0.4和2.0 g.L^?1。此外，量化了每个循环结束时获得的提取物中的酶活性。总纤维素酶活性随重复批次增加，这可归因于微生物随批次的适应——酵母可能增加了总纤维素酶的产生以更好地利用CMC，以及细胞回收过程中上清液保留导致的酶积累。其他酶（木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶）的活性在整个循环中下降，第三或第四批后稳定。这种差异行为在克隆在不同启动子下的酶组之间观察到：TEF1启动子下表达的XYL、BGL和BXL在连续批次中活性下降，而PGK1启动子下表达的总纤维素酶活性增加。开发AC14酵母的作者将这种启动子改变解释为避免TEF1启动子耗竭，但本研究结果表明这种改变可能影响了重复批次中与PGK1相关的酶生产。此外，酵母可能通过改变酶分泌谱来适应，随着简单糖耗尽而有利于降解残留底物（木聚糖、纤维素）的酶。所有循环中完全底物消耗证实了整个过程中实现了足够的降解。细胞活力在最后两个循环降至约70%。尽管酶生产下降，所有批次在11小时内实现了总糖完全转化，表明维持了足够的酶表达和活性。基于重复批次实验获得的平均乙醇产率，研究人员对AC14菌株在木质纤维素生物炼制中的乙醇生产潜力进行了理论估算。考虑巴西圣保罗州一个每小时加工833吨甘蔗、每天24小时、每年240天、87.5%运行率的工厂，湿甘蔗渣产量为240.9 t.h^?1。如果使用水热预处理甘蔗渣（35%纤维素和9%半纤维素）以10%（w/v）固体加载量实施CBP过程，可实现33,448 L.h^?1的乙醇生产，相当于每年增加264.9百万升（0.22 g乙醇/g加工甘蔗渣）。与Furlan等人评估的集成生物炼制1G和2G乙醇生产（使用同时异构化和发酵SIF的2G乙醇生产率为11,784.2 L.h^?1）相比，本研究估算的生产率约为其三倍，突出了CBP在生物炼制背景下实现高水平乙醇生产的潜力。

**讨论与结论**

S. cerevisiae AC14菌株因其分泌7种水解酶的能力而脱颖而出，并专门设计用于整合生物加工。整合具有这些特征的酵母可以显著改善CBP的乙醇生产。然而，该策略的成功取决于AC14响应的映射，不仅在其发酵性能方面，而且在酶生产效率方面。从本研究获得的结果中，建立了使用AC14酵母的CBP条件并确定了过程限制。表征了氧气供应、培养基组成和pH对使用AC14酵母的CBP的影响。培养基中木聚糖源的存在被证明对纤维素酶生产具有显著影响，这与菌株构建特征相关。总体而言，该酵母表现出优异的鲁棒性，实现了所有底物的完全转化，乙醇产率超过理论值的90%，且在发酵条件下具有高活力。CBP和乙醇生产的最佳条件包括由单体和复杂碳水化合物组成的培养基、pH 5.5和无氧气供应。成功进行了十次重复分批培养，底物完全转化且乙醇生产良好。总体而言，这些发现有助于阐明关键工艺条件对重组微生物水解酶生产的影响，旨在开发工业CBP。