《Biomarker Research》：Multi-omics, multi-tissue analysis reveal role of extracellular matrix remodeling and sphingolipid homeostasis in edematous malnutrition (kwashiorkor)
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背景：水肿型营养不良（edematous malnutrition，又称kwashiorkor）是重度营养不良的一种表型，其病理生理机制仍知之甚少。方法：在这项病例对照研究中，研究人员采用血浆脂质组学（lipidomics）、代谢组学（metabolomics
背景：水肿型营养不良（edematous malnutrition，又称kwashiorkor）是重度营养不良的一种表型，其病理生理机制仍知之甚少。方法：在这项病例对照研究中，研究人员采用血浆脂质组学（lipidomics）、代谢组学（metabolomics）和蛋白质组学（proteomics）、尿液代谢组学以及肠道微生物组（gut microbiome）分析，以刻画来自尼日尔（Niger）的60名6–59月龄儿童中kwashiorkor特有的分子特征，并与按年龄、性别和临床分诊评分匹配的消瘦型营养不良（marasmus，n = 60）儿童及非营养不良儿童（non-malnourished children，NAM，n = 60）进行比较。若某特征同时与水肿严重程度相关且在营养康复（nutritional rehabilitation）后恢复正常，则将其定义为kwashiorkor特异性特征。结果：研究人员鉴定出一个以lumican、gelsolin和tetranectin为特征的血浆蛋白质组学因子，以及一个富含鞘脂（sphingolipids）的脂质组学因子。二者在kwashiorkor中与marasmus和NAM相比均存在差异，与水肿分级相关，并在营养治疗后呈向正常化变化的趋势，这与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重塑和鞘脂失调相一致。相比之下，（血浆和尿液）代谢组学谱以及肠道微生物组组成均未显示kwashiorkor特异性特征，尽管研究人员的尿液和肠道微生物组分析可能检验效能不足。结论：这些发现超越营养素缺乏的层面推进了对kwashiorkor病理生理学的认识，并突显了与其区别于marasmus的独特临床和分子特征相关的ECM和鞘脂特征。
**研究背景与问题**
水肿型营养不良（edematous malnutrition），又称kwashiorkor，是一种以双侧水肿、脂肪肝和皮肤改变为特征的严重急性营养不良。它在临床和生化上与无水肿的营养不良（即marasmus或严重消瘦）截然不同：后者表现为低身高别体重（低于2006年WHO标准的?3 z评分）或中上臂围（mid-upper arm circumference，MUAC）低于115 mm（6–59月龄儿童）、可见肌肉萎缩和皮肤松弛。两者可同时存在，即marasmic kwashiorkor。Kwashiorkor在低收入国家是重要的公共卫生问题，但其实际患病率难以确定，因为基于人群的调查常未能捕获该病。尽管该病在临床上被认识已超过八十年，其病理生理的精确分子机制仍不完全清楚，这一知识空白阻碍了针对性干预与治疗策略的开发。
既往kwashiorkor被归因于蛋白质缺乏，但新出现的证据提示其病因是多因素的，涉及营养和环境因素的复杂交互。近期研究强调了氧化应激（oxidative stress）、免疫失调（immune dysregulation）以及肠道微生物组改变在kwashiorkor发生中的潜在作用。外源性毒物（包括玉米、花生、高粱和小米等主食中的黄曲霉毒素）也可能增加氧化应激并解释肝脏脂肪蓄积，但尽管在kwashiorkor患儿生物样本中检出黄曲霉毒素，因果关系尚未证实，反向因果的可能性亦未被排除。此外，代谢通路失调——特别是氨基酸代谢、一碳代谢（one-carbon metabolism）、细胞外基质（ECM）蛋白合成与分解以及内皮功能障碍（endothelial dysfunction）——被认为参与疾病过程，但整体分子机制仍有待阐明。为此，研究人员采用整合代谢组学、脂质组学、蛋白质组学和肠道微生物组数据的综合多组学方法，在治疗的不同阶段采集多种生物样本，与marasmus及非营养不良儿童比较，以探索其多层面病理生理学。该研究发表于《Biomarker Research》。
**关键技术方法**
研究为匹配的病例对照设计，在尼日尔Maradi地区Madarounfa卫生区开展（2018年9月26日至2019年11月5日），纳入180名6–59月龄儿童（kwashiorkor、marasmus、NAM各60名），按年龄、性别和分诊评分匹配，于入组时、出院时及门诊治疗结束时采集静脉血、粪便和尿液。主要技术包括：血浆与尿液非靶向代谢组学的液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析；血浆非靶向脂质组学（LC-MS/MS，基于MS-DIAL注释）；血浆非靶向自下而上（bottom-up）蛋白质组学（DIA-NN与SWATH采集）；粪便16S rRNA基因扩增子测序及QIIME2微生物组分析；临床生化与即时检验（i-STAT）；以及因子分析（factor analysis，FA）潜变量（latent variable，LV）构建与偏相关网络整合分析。
**研究结果**
*参与者特征*：共纳入180名儿童，60%为女性，年龄类别均分（50%为6–23月龄，50%为24–59月龄）。60名kwashiorkor患儿中12名有至少一种皮肤病变，且这些患儿多为中至重度水肿。身高别年龄z评分提示普遍存在生长迟缓（stunting）。各组多数儿童非危重，仅每组1名儿童按分诊评分为急诊病例。NAM儿童疟疾快速诊断试验阳性率更高且儿童早期预警评分（PEWS）更高；marasmus儿童更常患腹泻。2名kwashiorkor参与者死亡。
*Kwashiorkor、marasmus与非营养不良儿童整合血浆脂质组、代谢组、蛋白质组及临床生化*：血浆蛋白质组学分析显示，在308个蛋白特征中，kwashiorkor与marasmus和NAM合并组相比有121个蛋白上调、44个下调（FDR p值 < 0.05）（图1a）。但检验其与水肿严重程度的关系时，无一通过标准2（图1b）。因子分析将蛋白质组数据降为9个蛋白质组潜变量（pLV）。9个pLV中7个在kwashiorkor中存在差异（pLV1、3、4、5、7在kwashiorkor中较高，pLV2和9较低），通过标准1（图1c）。与水肿严重程度回归分析显示仅pLV7与基线kwashiorkor水肿严重程度加重显著相关（图1d），且其在基线高于非kwashiorkor儿童，在营养治疗期间及之后显著下降（图1e），满足全部3项标准。pLV7的组成蛋白包括ECM蛋白lumican、gelsolin和tetranectin。1000次参与者水平bootstrap评估显示，完整pLV7载荷模式稳定性中等（平均Tucker一致性系数0.67；中位数0.71；95% bootstrap区间0.25–0.90），但针对三蛋白核心评估时平均Tucker一致性系数为0.95（中位数0.99；95% bootstrap区间0.48–0.99），lumican、gelsolin和tetranectin分别在80%、72%和73%的bootstrap样本中保持绝对载荷 ≥ 0.40，符号一致性分别为99%、98%和95%，表明三蛋白ECM相关核心在pLV7中被稳定回收。三种蛋白在50种人体器官中有41种共表达，但表达最高的器官不同：lumican在胆囊、gelsolin在心肌、tetranectin在脂肪组织（图1g）。排除疟疾阳性儿童的敏感性分析及仅纳入尿液试纸血/蛋白阴性kwashiorkor儿童的敏感性分析均显示pLV7与kwashiorkor的关联稳健，但样本量较小导致效能降低（补充图1）。
血浆脂质组学：在506个脂质特征中，kwashiorkor与marasmus和NAM合并组相比有22个脂质上调、136个下调（FDR p值 < 0.05）（图2a），但无一通过标准2（图2b），故未发现单一脂质种类与kwashiorkor强相关。因子分析将脂质组数据降为21个脂质潜变量（lLV），bootstrap显示lLV5载荷模式稳定性强（平均Tucker一致性系数0.91；中位数0.94；95% bootstrap区间0.57–0.98，平均保留率78%，平均符号一致性99%）。21个lLV中9个在kwashiorkor中存在差异（lLV14和16较高，lLV1、2、5、10、13、15和20较低），通过标准1（图2c）。回归分析显示lLV5和lLV16与基线水肿严重程度加重显著相关（图2d），但仅lLV5在整个治疗过程中显著变化（图2e）：基线时kwashiorkor低于非kwashiorkor，治疗后血浆水平升高，使其成为强候选生物标志物特征。lLV5的组成脂质以17种单不饱和至双不饱和鞘磷脂（sphingomyelins，SM 35:1、37:2、38:1、38:2、39:1、40:0、40:1、40:2、41:0、41:1、42:0、42:1、42:2、43:1、44:0、44:1和44:2）为主，另有5种多不饱和胆固醇酯（16:2、18:3、20:4、20:5、22:6）、神经节苷脂GD3（42:1）、4种饱和己糖基神经酰胺（HexCer 39:0;O3、HexCer 40:0;O3、HexCer 41:0;O3和HexCer 42:0;O3）、醚键溶血磷脂酰胆碱（LPC O-24:0）以及磷脂酰胆碱（PC 20:0、PC 22:0、PC 22:3、PC 37:1）。所有组成脂质在入院时呈强正相关。两项敏感性分析（排除疟疾阳性者、仅纳入尿血/蛋白阴性者）均显示lLV5与kwashiorkor关联稳健（补充图2）。
血浆代谢组学：血浆非靶向（半极性）代谢组学正负离子模式合计产生2825个特征。条件logistic回归显示60个代谢物特征在kwashiorkor与marasmus和NAM合并组间存在差异（FDR p值 < 0.05）（图3a），但无一通过标准2（图3b）。因子分析提取16个代谢组潜变量（mLV），仅mLV5和mLV7通过标准1。检验其与水肿严重程度的关系，无血浆mLV满足全部3项标准，故未发现与kwashiorkor相关的半极性代谢组特异性通路。
血浆多组学共调控：研究人员采用偏相关网络分析确定基线时（全部三组）各模块与临床生化结果之间的关联模式（图4a）。pLV7（代表ECM蛋白）与血浆总蛋白负相关、与血钠浓度正相关；lLV5与血浆总蛋白、血清总胆固醇、lLV10和lLV13正相关，与pLV4和pLV5负相关。lLV10由15种主要为磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine）的脂质组成，lLV13由5种不饱和鞘磷脂组成；二者在kwashiorkor与非kwashiorkor间存在差异，但水平与kwashiorkor严重程度无关。lLV5与pLV7彼此不直接相关（图4c），尽管二者均与血浆总蛋白相关。与文献及既往研究一致，kwashiorkor血浆总蛋白低于marasmus和NAM，但组间存在明显重叠；许多marasmus和NAM儿童血总蛋白低却未表现kwashiorkor综合征。敏感性分析中这些关联保持稳健。研究人员指出偏相关网络可减少但不能消除共享上游过程（如炎症、疾病严重程度或整体营养状态）的混杂，故所观察关联应解释为协调的分子特征而非直接生物学相互作用。
*Kwashiorkor、marasmus与NAM儿童的尿液代谢组及临床生化*：因获取尿液样本困难，仅获得88名儿童基线尿液样本（kwashiorkor 24名、marasmus 32名、NAM 32名）。正负离子模式合计产生4570个尿液代谢组特征。因子分析将数据降为8个尿液代谢组潜变量（uLV），因仅有入组时尿液，仅应用标准1和2。结果无uLV与kwashiorkor相关（图5）。
*Kwashiorkor、marasmus与NAM儿童的肠道微生物组组成*：入组180名儿童中仅成功采集38份粪便样本（kwashiorkor 14名、marasmus 13名、NAM 11名），行16S rRNA基因扩增子测序。基于Bray-Curtis和Jaccard距离的主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）显示，无论总体还是按组、年龄、性别和分诊评分均无清晰聚类（图6a），PERMANOVA分析亦无组间显著差异；α多样性指标（Shannon、Faith Phylogenetic、Pielou）在三组间无差异（图6b）；ANCOM模块在科、属和株分类水平上组间及两两分析均未报告差异丰度特征（p > 0.05）（图6c）。
**讨论与结论**
讨论部分指出，研究人员鉴定出ECM降解和鞘脂紊乱作为kwashiorkor的生物标志物，有助于深化对其病理生理学的理解；严格的多组学设计揭示的潜变量在kwashiorkor与marasmus和NAM间存在差异、与水肿严重程度相关并在治疗后正常化，从而刻画了超越单纯营养缺乏的kwashiorkor特异性特征，提示适应不良的组织重塑和脂质信号传导。研究按年龄、性别和项目化临床分诊评分匹配，尤其匹配分诊评分作为入院临床严重程度的代理，原因包括：无明显疾病的NAM儿童仅凭疾病严重程度即可与患病营养不良儿童区分；某些疾病更常与某一类型共现（如HIV和疟疾更多与marasmus共现）；有报道kwashiorkor死亡率高于marasmus，亦有相反报道。匹配虽不完美，但可在一定程度上区分与kwashiorkor相关的通路而非临床共病，不过组间仍存在差异，NAM儿童疟疾快速试验阳性率明显更高。本研究进一步强化了既往关于ECM重塑/降解在kwashiorkor病理生理中作用的发现：此前在肯尼亚和马拉维儿童中已显示lumican在kwashiorkor中高于marasmus、与水肿严重程度相关并在治疗中消退，但既往研究未纳入NAM儿童且仅聚焦蛋白质组学。本研究中由lumican、gelsolin和tetranectin组成的pLV满足全部生物标志物标准，强化了ECM重塑的作用。Lumican是一种小型富含亮氨酸的蛋白聚糖，调节胶原纤维形成和组织完整性；Gelsolin是一种肌动蛋白结合蛋白，通过清除肌动蛋白丝和调节炎症影响ECM，血浆gelsolin（pGSN）在肌动蛋白清除和免疫调节中起关键作用，其水平在组织损伤、继发性器官损伤和脓毒症中显著降低，但在结肠癌、胰腺癌、胰腺炎和HIV中升高；Tetranectin增强纤溶酶原激活，对纤维蛋白溶解和ECM分解很重要。pLV7蛋白循环丰度增加可能源于合成或分泌增强、ECM重塑或降解期间从组织释放增加，或清除与再分布改变。既往蛋白动力学研究显示kwashiorkor儿童全身蛋白质合成显著降低，使全身性蛋白合成增加不太可能是解释，但个别蛋白的选择性合成不能排除；因此研究人员推测循环pLV7特征最可能反映组织重塑或降解期间ECM相关蛋白释放增加，但当前蛋白质组分析不能区分完整蛋白与蛋白水解片段，也不能确定组织来源，该解释应视为需通过片段特异性检测和组织水平研究确认的生物学合理假说。借助人类蛋白质组图谱，研究人员推断pLV7代表全身性ECM分解，因为这些蛋白在包括淋巴系统和肝脏在内的多种器官中共表达；既往发现kwashiorkor血浆淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE1）水平高于marasmus，且在出院后60天营养康复后降低，提示淋巴系统ECM降解。淋巴系统完整性功能障碍可能在kwashiorkor水肿形成中起主要作用，因为它是间质液回流循环的主要途径（修订的Starling模型）；淋巴ECM降解所致淋巴损伤可能促进水肿形成。此外，ECM蛋白是支撑整个血管系统内皮细胞的血管壁主要成分，血管壁ECM降解将导致血管渗漏和毛细血管膜通透性增加，进一步促使液体漏入间质。ECM还是钠的重要储存库，带负电的ECM（特别是糖胺聚糖）相互作用可储存非渗透性Na+离子，故ECM是钠平衡的组成部分和动态成分；网络分析显示总血钠与pLV7正相关，ECM完整性破坏可能影响钠平衡并导致kwashiorkor水潴留。研究显示kwashiorkor儿童血钠浓度高于marasmus和NAM，与既往发现一致，但尽管存在统计学差异，所有儿童血钠中位数仍在正常范围内；本研究未发现kwashiorkor与marasmus尿钠差异，但两者尿钠均低于NAM。ECM稳态失调亦与肝脏病变（包括肝纤维化和非酒精性脂肪性肝病）相关，全身ECM稳态失调是否直接参与kwashiorkor相关肝脏脂肪浸润尚不清楚，但其在其他肝病中的作用使这一可能具有合理性。研究还发现脂质代谢与kwashiorkor强相关，特别是lLV5，其捕捉鞘磷脂、神经酰胺和神经节苷脂特征；这些统称鞘脂的脂质是细胞膜（尤其中枢神经系统）的关键结构成分，在细胞信号、增殖和凋亡中起关键作用；神经酰胺是核心分子，可修饰形成鞘磷脂并进一步与糖脂缀合产生神经节苷脂，故lLV5很可能反映整体鞘脂稳态。循环鞘脂主要由肝脏和肠道合成，仅小部分直接来源于膳食，这可能提示这些器官的紊乱是kwashiorkor发生的基础；网络分析显示lLV5与血清总胆固醇、lLV10（磷脂酰乙醇胺类脂质）和lLV13（不饱和鞘磷脂）相连，提示lLV5可能反映参与脂质转运的通路（可能在肝脏），但结果不能支持该假说，需更深入研究。研究结果还可在若干历史和当代kwashiorkor病理生理假说框架下解读：氧化应激长期被认为是kwashiorkor的核心驱动因素，活性氧可直接通过激活基质重塑酶促进ECM降解并破坏膜脂组成（包括鞘脂代谢），本研究中ECM重塑标志物升高与鞘脂相关脂质降低并存与慢性氧化损伤状态相容，但数据不能确定氧化应激是否为始动事件；免疫激活和炎症常被认为与kwashiorkor相关，ECM重塑和鞘脂代谢均与炎症信号紧密相连，ECM降解产物可作为炎症介质，鞘脂调节免疫细胞运输、细胞因子产生和血管反应，两种特征与水肿严重程度的强关联及其在恢复期的正常化提示它们可能是持续炎症过程的下游表现；研究结果还可为既往观察到的kwashiorkor内皮功能障碍提供背景，血管屏障完整性的维持依赖内皮细胞、ECM蛋白和膜脂的协调相互作用，ECM结构紊乱伴鞘脂稳态改变可能促进血管通透性增加和液体处理受损。综上，这些发现进一步支持新出现的观点：kwashiorkor水肿不能仅用低白蛋白血症解释，而是反映组织结构完整性和脂质介导细胞稳态的更广泛紊乱。非靶向半极性代谢组学未发现满足全部kwashiorkor生物标志物标准的代谢物或代谢组潜变量；然而一项比较kwashiorkor与marasmus的靶向代谢组学研究显示两者代谢组存在重大差异，kwashiorkor血清中定量的141种代谢物中有128种（91%）低于marasmus；另一项定量代谢物谱研究发现在kwashiorkor和marasmic-kwashiorkor血清中参与一碳代谢的代谢物（尤其是蛋氨酸和胆碱）低于marasmus；但研究人员既往按血清白蛋白匹配的靶向代谢组学研究显示两组血清氨基酸浓度几乎完全重叠，仅苯丙氨酸在kwashiorkor中较低；与本研究类似，既往一项非靶向代谢组学研究未发现尼日利亚kwashiorkor与marasmus儿童间的半极性代谢组差异。代谢组可能更易受地域差异影响，导致不同国家研究结果不一致；此外鉴于kwashiorkor整体液体潴留增加，小分子亲水代谢物可能同时分布于血管内和间质空间，使其在kwashiorkor中的表观浓度降低；本研究结果并不提示kwashiorkor血管内空间增加；内皮糖萼作为蛋白跨内皮进入间质的屏障，而代谢物跨内皮运动仍有待深入研究。关于肠道微生物组，既往马拉维营养不良不一致双胞胎研究显示，将kwashiorkor儿童粪便移植给无菌小鼠可导致营养不良表型，而移植非营养不良双胞胎粪便则不会，但该研究未纳入marasmus儿童，难以确定效应是kwashiorkor特异还是普遍营养不良或临床共病所致，且未报告小鼠模型出现水肿；与本研究类似，既往研究亦未发现kwashiorkor与marasmus间肠道微生物组差异；但鉴于样本量小、生活条件相似和胃肠炎病例有限，不能排除kwashiorkor或marasmus儿童与NAM组间的微生物组差异；本微生物组分析仅作为探索性比较，研究人员承认检测分类或功能差异的效能有限，未来需更大规模研究。研究局限性包括：采用针对高维数据优化的快速无矩阵最大似然因子分析，可能存在因子不稳定性，但已显示所获因子具有中等至良好稳定性；采用旨在识别需立即救治儿童的实用分诊评分进行匹配，但该评分及匹配可能不够理想或详细；每组仅60名儿童，仅提供探索性视角；若干现场后勤操作可能未达到高收入环境的质量标准，且出于安全原因部分内容（如皮肤病变数据采集）不得不远程培训现场人员，可能导致检出病例患病率偏低；未区分kwashiorkor与同时存在消瘦和水肿（marasmic-kwashiorkor）的儿童，所有出现营养性水肿的儿童均被视为kwashiorkor而不论是否消瘦；结果未在独立儿童队列中验证，需在其他环境开展研究以确保可重复性，但当前结果与既往研究的一致性为发现的有效性提供了保证；因子分析在各组学层内分别进行、跨组学关系随后用偏相关评估，整合策略未明确建模跨组学平台的共享变异，故无法确定ECM重塑和鞘脂稳态失调是独立生物学过程、序贯事件还是共同上游因素（如炎症或疾病严重程度）的平行表现，未来需更大规模研究检验共享及组学特异变异来源并评估推定因果通路。
结论译文：这些观察提示，严重营养不良、尤其是kwashiorkor，不仅仅是营养素缺乏状态，而是一种重构全身分子相互作用的多层面生理状况。这导致ECM重塑增加和鞘脂稳态失调，提示kwashiorkor可能与非典型炎症反应相关。是否需特定炎症触发因素才能发展为kwashiorkor，或kwashiorkor儿童无论刺激如何都易出现炎症反应失控，仍有待研究。
