基于Illumina Infinium Methylation Screening Array (MSA)的颊黏膜DNA甲基化谱预测时序年龄、表型年龄及临床实验室生物标志物：两阶段残差学习研究

《Epigenetics Communications》：Predicting biological age and clinical biomarkers from DNA methylation profiles of cheek mucosa

背景：基于DNA甲基化（DNA methylation）的生物标志物已被广泛用于预测生物学年龄（biological age）；然而，现有模型大多使用血液来源数据，颊黏膜（cheek mucosa）能否作为基于甲基化估计衰老相关及临床表型的替代指标尚不清楚。方法：研究人员使用Illumina Infinium Methylation Screening Array (MSA)分析了186名日本成人颊黏膜和全血（whole blood）的DNA甲基化谱。构建模型以从颊黏膜和血液来源的甲基化数据预测时序年龄（chronological age）、表型年龄（phenotypic age）和临床实验室生物标志物（clinical laboratory biomarkers）。除应用普通弹性网络（elastic net）方法外，研究人员还应用了一种纳入现有血液来源表观遗传时钟（epigenetic clocks）的两阶段残差学习（two-stage residual learning）方法，以更准确地预测生物学年龄。研究人员进行了按性别分层（sex-stratified）分析，并比较了不同性别和组织间所选CpG特征（CpG features）。结果：使用两阶段方法，颊黏膜来源的MSA甲基化数据能够准确预测时序年龄（R = 0.965）和表型年龄（R = 0.964）。两阶段方法带来的性能提升对表型年龄大于对时序年龄。颊黏膜来源的甲基化数据可预测多种临床实验室生物标志物，尤其是在性别分层后，包括炎症、代谢、甲状腺相关和性激素相关标志物。大多数可通过血液来源甲基化数据预测的生物标志物也可通过颊黏膜来源甲基化数据预测。然而，尽管相应可预测表型存在重叠，所选用于预测的CpG位点（CpG sites）在性别和组织间重叠极小。结论：使用MSA测定的颊黏膜来源DNA甲基化谱可预测时序年龄、表型年龄和多种临床相关实验室生物标志物，支持颊黏膜作为一种侵入性更小的替代方案，用于基于甲基化的生物学衰老和全身生理状态评估。

研究背景与问题：DNA甲基化（DNA methylation）生物标志物可用于以临床可解释的方式量化生物学衰老，表观遗传时钟（epigenetic clocks）如Horvath、Hannum及第二代PhenoAge、GrimAge等已提高衰老评估的临床相关性。然而，多数既有表观遗传时钟主要基于血液来源DNA建立和验证，采血具有侵入性，重复或大规模纵向监测存在程序负担和依从性挑战；DNA甲基化谱具有强组织依赖性，一种组织建立的预测模型不一定可直接迁移至另一组织。颊黏膜（cheek mucosa）和口腔上皮样本可无创、重复采集且参与者负担较低，已有研究提示颊黏膜甲基化数据可支持年龄预测并捕捉衰老相关变异，但颊黏膜来源甲基化谱能在多大程度上恢复临床相关衰老表型和血液相关生理信息仍不清楚，尤其是在使用甲基化筛选芯片（MSA）和非欧洲人群时。基于此，研究人员在日本人队列中评估颊黏膜MSA数据预测时序年龄（chronological age）、表型年龄（phenotypic age）及临床实验室生物标志物的可行性，比较颊黏膜与血液MSA数据的预测表现，并分析性别和组织间所选CpG特征（CpG features）的重叠与差异。研究结论提示，颊黏膜MSA甲基化谱可预测时序年龄、表型年龄和多种临床相关实验室生物标志物，支持颊黏膜作为较少侵入的替代方案用于基于甲基化的生物学衰老和全身生理状态评估，并强调组织与性别感知建模的重要性。

关键技术方法：研究纳入186名日本健康成人志愿者，配对颊黏膜和全血样本采集于Y’s Science Clinic Hiroo（东京都港区），项目为“Evaluation of Biological Age Based on DNA Methylation and Its Clinical Significance”，经Shiba Palace Clinic伦理审查。颊黏膜和全血DNA甲基化用Illumina Infinium MSA分析，全血另用Illumina Infinium HumanMethylationEPIC v2 BeadChip（EPICv2）计算参考时钟；采用SeSAMe流程（noob背景校正、pOOBAH过滤）预处理。按PhenoAge九项临床生物标志物计算表型年龄。用弹性网络（elastic net）构建年龄和59项临床实验室生物标志物预测模型，80%训练、20%留出测试，五折交叉验证；用两阶段残差学习（ridge加elastic net）整合Horvath、Hannum、PhenoAge、GrimAgeV2和J-PhenoAge；进行性别分层模型、Jaccard指数比较CpG重叠，Welch t检验和Benjamini–Hochberg假发现率（BH-FDR）识别性别/组织相关CpG。参照Shoji等所述流程。

研究结果：（1）颊黏膜来源MSA数据预测时序年龄和表型年龄：在留出测试集中，两阶段模型预测时序年龄R = 0.965、MAE = 2.602、RMSE = 3.311，预测表型年龄R = 0.964、MAE = 3.405、RMSE = 4.217；一阶段模型对应时序年龄R = 0.947、MAE = 3.277、RMSE = 4.118，表型年龄R = 0.854、MAE = 6.214、RMSE = 8.432。两阶段较一阶段的提升在表型年龄更明显，校准斜率也更接近1。（2）与血液表观遗传时钟比较：颊黏膜一阶段和二阶段模型与时序年龄相关血液时钟Horvath、Hannum呈强相关，与血液PhenoAge相关相对较低；一阶段颊黏膜模型与Horvath、Hannum、PhenoAge分别仅共享5、10、3个非零CpG，提示相似年龄估计可由 largely distinct 特征集产生。（3）颊黏膜MSA数据预测临床生物标志物：全体参与者中肌酐和游离睾酮预测较高（R > 0.6）；控制性别后肌酐、血红蛋白等减弱，游离睾酮仍较好（R > 0.6且偏R > 0.3）。（4）颊黏膜MSA数据按性别分层预测临床生物标志物：性别分层普遍提高多个标志物预测，男女均R > 0.6者包括磷、C反应蛋白（CRP）、雌二醇、高敏前列腺特异性抗原（PSA）、淋巴细胞计数、黄体生成素（LH）、血清铁、白蛋白、镁、总蛋白、A/G比、血糖、嗜酸性粒细胞计数、硫酸脱氢表雄酮（DHEA-S）、游离甲状腺素（free T4）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GTP）、血尿素氮（BUN）、孕酮、钾、钙、促甲状腺激素（TSH）、白细胞计数（WBC count）、平均血红蛋白浓度（MCHC）、血小板计数、总睾酮、红细胞分布宽度变异系数（RDW-CV）、高密度脂蛋白（HDL）胆固醇、游离睾酮、单核细胞计数、钠、碱性磷酸酶（ALP/IFCC）、乳酸脱氢酶（LD/IFCC）、中性粒细胞计数等；血红蛋白、红细胞计数、尿酸、平均红细胞体积（MCV）、α1-球蛋白等较低；部分标志物呈性别依赖预测。（5）按性别比较所选CpG特征：多数生物标志物男女模型所选CpG重叠小、Jaccard指数低；约20%所选CpG与全基因组性别相关甲基化差异重叠。（6）血液来源MSA数据预测临床生物标志物：全体中血红蛋白、红细胞计数、肌酐、游离睾酮R > 0.6；控制性别后部分减弱，游离睾酮仍较一致；性别分层提高多个标志物预测，男女均R > 0.6者包括红细胞计数、肌酐、磷、雌二醇、PSA、淋巴细胞计数、LH、白蛋白、总蛋白、A/G比、ALP、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、嗜酸性粒细胞计数、MCHC、DHEA-S、BUN、孕酮、HDL胆固醇、钾、钙、WBC count、血小板计数、β-球蛋白、总睾酮、RDW-CV、N末端B型利钠肽原（NT-proBNP）、游离睾酮、单核细胞计数、嗜碱性粒细胞计数、钠、氯、卵泡刺激素（FSH）、低密度脂蛋白（LDL）胆固醇、ALP/IFCC、LD/IFCC、中性粒细胞计数等；血红蛋白、血清铁、CRP、血细胞比容较低；男女模型CpG重叠小，约20%与性别相关CpG重叠。（7）比较颊黏膜与血液MSA数据生物标志物预测：男女中颊黏膜可较好预测的标志物通常血液也较好预测，但个别标志物性能不同；总体上可预测标志物集合存在重叠；两组织所选CpG重叠极小，但多数所选CpG与组织相关甲基化差异重叠，提示相似临床表型可由不同组织相关CpG特征编码。

讨论部分总结：研究显示颊黏膜MSA可预测时序年龄、表型年龄和多种临床相关实验室生物标志物；两阶段残差学习对表型年龄提升明显，提示既有血液表观遗传时钟信息可与颊黏膜MSA特异甲基化信号整合，以捕捉时钟未解释的残差变异。多种生理生物标志物可从颊黏膜甲基化数据预测，但表现受性别影响显著；性别分层改善预测，且男女模型CpG特征重叠有限，支持生理性状相关甲基化信号具有性别依赖性。跨组织比较显示，尽管颊黏膜和血液可预测相似的生物标志物集合，其模型所用CpG特征 largely distinct 且多与组织相关甲基化差异重叠，提示相似表型可由部分独立的表观遗传配置编码。原文还指出定量CRP从颊黏膜预测较好可能具有临床相关性；炎症、代谢、内分泌和激素相关标志物可预测提示外周组织甲基化可能编码激素和代谢信号的下游生理后果。局限包括单一人群、缺乏外部验证、亚临床疾病/用药/生活方式信息不全、颊黏膜未用EPICv2或测序验证、平台泛化性未测。

研究结论翻译：综上所述，使用Illumina Infinium MSA从颊黏膜获得的DNA甲基化谱能够在日本队列中预测时序年龄、表型年龄和多种临床相关实验室生物标志物。两阶段残差学习对改善表型年龄预测尤其有效，提示将既有血液表观遗传时钟信息与颊黏膜来源甲基化特征整合可能增强复杂衰老相关表型的估计。炎症、代谢、内分泌和激素生物标志物可从颊黏膜来源甲基化数据预测，突显口腔上皮甲基化谱包含更广泛的生理信息。不同性别和组织间所选CpG特征显著差异进一步表明，生物学知情、情境感知的建模策略对基于甲基化的表型分析很重要。总体而言，这些发现支持颊黏膜作为较少侵入的替代方案用于生物学衰老和全身生理状态评估的潜力。