《Genome Medicine》：Multikingdom and functional gut microbiota markers for cholangiocarcinoma
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虽然肠道微生物与胆管癌（Cholangiocarcinoma, CCA）之间的关联已被探索，但现有研究局限于细菌组分。CCA中非细菌成员（真菌、古菌和病毒）及其功能特征的改变仍不清楚。本研究旨在全面表征CCA患者的多界肠道微生物谱和功能特征，并开发一种无创诊断
虽然肠道微生物与胆管癌（Cholangiocarcinoma, CCA）之间的关联已被探索，但现有研究局限于细菌组分。CCA中非细菌成员（真菌、古菌和病毒）及其功能特征的改变仍不清楚。本研究旨在全面表征CCA患者的多界肠道微生物谱和功能特征，并开发一种无创诊断模型。
研究人员在中国三个不同区域对700份粪便样本进行了宏基因组测序（metagenomic sequencing），包括289例CCA患者、312例健康对照（healthy controls）和99例肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）患者。分析了多界微生物组成和功能谱。研究人员整合多种机器学习（machine learning）算法，生成117种不同的建模方案，用于构建和筛选最佳的CCA诊断模型。该模型在三个独立队列中得到验证，并测试了与HCC的特异性。研究人员还通过与15份CCA临床实践指南/共识声明及其引用的证据进行回顾，并通过评估模型在CA19-9阳性和CA19-9阴性患者中的检测情况，将该模型与已建立的诊断方法进行了基准测试。
在CCA患者中发现了广泛的多界和功能层改变，包括198个古菌（archaea）、154个细菌（bacteria）、78个真菌（fungi）和120个病毒（virus）物种，以及278个基因（genes）、99条通路（pathways）和151个碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes, CAZymes）。由21个多界和功能标志物组成的面板在三个验证队列中展示了卓越的诊断准确性，平均曲线下面积（area under the curve, AUC）为91%，优于任何单界模型。该模型在区分CCA与HCC时表现出高特异性，AUC达到99.74%，假阳性率为11.11%。基准测试支持其作为无创筛查辅助手段的补充作用，模型显示出合并敏感性和特异性分别为96.2%和78.5%，并检测到了97.6%的CA19-9阴性CCA病例。
本研究首次对胆管癌的多界肠道微生物组和功能标志物进行了全面表征。肠道多界和功能微生物特征代表了有前景的无创工具，可能有助于高危人群中胆管癌的筛查和早期识别，补充现有诊断方法。
胆管癌（Cholangiocarcinoma, CCA，起源于胆管上皮的恶性肿瘤）是第二常见的原发性肝脏恶性肿瘤，约占所有胃肠道肿瘤的3%，具有高度侵袭性和高死亡率，五年生存率通常低于20%。由于早期症状隐匿或非特异性，多数患者确诊时已处于局部晚期或转移性阶段，失去根治性切除机会。现有诊断手段存在明显局限：血清标志物CA19-9缺乏足够敏感性，且在Lewis抗原阴性个体中无法产生；横断面成像在肝硬化背景下易将肝内胆管癌（intrahepatic CCA, iCCA，位于肝脏内部的胆管癌亚型）误诊为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC，最常见的原发性肝癌类型），且难以区分恶性或良性胆道狭窄；组织学确诊依赖有创、依赖操作者的取材方式且灵敏度有限。对于原发性硬化性胆管炎、肝硬化、慢性病毒性肝炎、胆石症或肝吸虫感染等高危人群，目前缺乏有效的无创筛查和监测工具。近年来，“肠-肝轴”（gut-liver axis，肝脏与肠道通过门静脉、胆道和全身循环的双向通讯）研究为理解CCA发病机制提供了新视角，但现有微生物研究多局限于细菌组分，对真菌、古菌和病毒等非细菌成员在CCA中的改变及其功能特征仍缺乏系统认识，这限制了基于微生物的无创诊断策略的开发。
研究人员基于中国东部、中部和西北部三个地理区域的四个独立队列，纳入700份粪便样本（289例CCA患者、312例健康对照、99例HCC患者），采用鸟枪法宏基因组测序（shotgun metagenomic sequencing，直接对样本中所有DNA进行测序的技术）获取微生物组成与功能信息。通过Kraken 2进行多界分类学分析，MEGAHIT组装、Prodigal基因预测、EggNOG-mapper功能注释解析KO基因（KEGG Orthology）、KEGG通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）和CAZymes。研究整合9种机器学习算法构建117种建模策略，在杭州发现队列训练，在郑州、新疆及HCC队列验证。采用LEfSe、Wilcoxon秩和检验及MaAsLin2（Microbiome Multivariable Association with Linear Models，用于微生物组与临床表型关联分析的线性模型）筛选差异特征，以受试者工作特征曲线下面积（area under the curve, AUC，衡量诊断模型准确性的指标）评估模型性能，并通过ComBat校正批次效应。
研究特征与队列概况：四个队列共700人中，各队列CCA组与对照组的性别和年龄均无显著差异，有效控制了人口学混杂。
CCA与肠道多界微生物多样性及组成的关联：研究人员通过Shannon指数评估α多样性，发现CCA患者细菌和病毒物种的α多样性较健康对照显著降低。组内Bray-Curtis不相似性分析显示，CCA患者四个微生物界的组内异质性均增加。经协变量校正的主坐标分析（adjusted Principal Coordinate Analysis, aPCoA，一种考虑混杂因素的排序分析）显示古菌、细菌和真菌界在CCA患者与对照间明显分离。差异丰度分析显示，健康对照组富集了产丁酸菌如Faecalibacterium prausnitzii和Bifidobacterium属，而CCA组富集了Klebsiella pneumoniae等潜在致病菌。古菌、真菌和病毒界也呈现显著改变，且CCA患者中存在广泛的界间关联，特别是细菌与古菌之间的相互作用。
CCA相关的肠道微生物功能改变：功能分析显示，CCA患者在KEGG通路和碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes, CAZymes，参与碳水化合物合成与降解的酶类）水平的α多样性显著增加，而KO基因水平无显著变化；β多样性在三个功能水平均显著降低，提示物种组成异质性增加但功能谱趋于一致。CCA组富集了与外在膜受体、药物外排泵、铁载体摄取系统、ABC转运蛋白、群体感应、磷酸转移酶系统、细菌分泌系统相关的KO基因，以及多个糖苷水解酶（如GH43、GH2、GH92、GH97）和碳水化合物酯酶（如CE11、CE0、CE8）家族，表明CCA相关微生物组的代谢潜力向复杂碳水化合物降解方向显著偏移。
多界和功能性肠道微生物特征与CCA临床表型的关联：PERMANOVA（Permutational Multivariate Analysis of Variance，置换多元方差分析，一种多变量统计方法）分析显示疾病状态是影响所有七个数据层微生物和功能谱的最主要因素，其中CAZyme功能谱受CCA状态影响最大（R
2=27.0）。肿瘤部位对真菌群落解释力最强（R
2=15.9%），肿瘤大小与771个差异特征显著相关。随着肿瘤增大，产丁酸菌如Anaerobutyricum hallii和Anaerostipes hadrus丰度显著下降，而潜在致病菌如Mycobacterium canettii增加。脂多糖（lipopolysaccharide, LPS，革兰阴性菌细胞壁中的促炎成分）生物合成通路与肿瘤大小呈强正相关（r=0.52, p<0.001），揭示了CCA中肠道微生物失调的模式，即有益微生物及其代谢功能丧失，潜在致病菌及促炎成分富集。
单一微生物界和功能标志物用于CCA诊断：基于训练集构建的诊断模型显示，各单一界和功能标志物均具有一定诊断价值：古菌最佳模型（XGBoost+Lasso）平均AUC为82.2%，细菌（Enet+GBM）达90.8%，真菌（RF+GBM）为86.7%，病毒（GLM+RF）为89.9%，KO基因、KEGG通路和CAZymes分别为80.7%、79.9%和76.6%。
多界和功能肠道微生物标志物用于CCA诊断：多界集成模型表现优于任何单一界模型。基于梯度提升机（Gradient Boosting Machine, GBM，一种基于决策树的集成学习算法）的最优集成模型包含21个特征（2个古菌、13个细菌、2个真菌、3个病毒、1个KO基因），在杭州测试集、郑州和新疆验证集中AUC分别为100%、91.9%和81.2%，平均AUC达91%。病毒特征Valbvirus ValB1MD2和Andhravirus andhra以及细菌Mycobacterium canettii对模型贡献最大。
跨解剖亚型的微生物改变与诊断性能：iCCA、肝门胆管癌（perihilar CCA, pCCA，位于肝门部的胆管癌亚型）和远端胆管癌（distal CCA, dCCA，位于胆总管远端的胆管癌亚型）与健康对照相比，细菌和真菌α多样性及KO基因功能能力均显著改变（p<0.001）。古菌α多样性改变特异于iCCA。诊断模型在不同解剖亚型中表现一致，灵敏度分别为iCCA 94.96%、pCCA 96.08%和dCCA 100%。
多界集成模型的疾病特异性：模型区分CCA与HCC的AUC达99.74%，灵敏度95.24%，特异性94.95%，假阳性率11.11%。敏感性分析显示该判别独立于HBV感染状态和人口学特征：HBV阴性CCA对HBV-HCC的AUC为99.96%，HBV阳性CCA对HBV-HCC为99.71%，年龄性别匹配子集（42例CCA对42例HCC）AUC为99.66%。
与已建立诊断方法的比较：系统回顾2023至2026年间15份CCA临床指南。该粪便模型区分CCA与健康对照的准确度为0.87，灵敏度0.962，特异性0.785，合并AUC为0.933。在266例有CA19-9检测结果的CCA患者中，69.17% CA19-9升高；模型对CA19-9阳性患者检测率为95.11%，对CA19-9阴性患者达97.56%。按Child-Turcotte-Pugh（CTP，评估肝脏储备功能的分级系统）分级，灵敏度从CTP-A的98.62%降至CTP-C的85.00%。
讨论部分指出，本研究首次系统描绘了CCA多界及功能性肠道微生物图谱，21个标志物构成的集成模型为无创诊断提供了可靠工具。模型特征反映了CCA肠道失调的本质，包括产丁酸菌减少、潜在致病菌和促炎成分增加，以及糖代谢和甘氨酸代谢的改变。研究还发现核心细菌和真菌改变在不同解剖亚型间共享，而古菌改变在iCCA中更显著，提示肠-肝轴可能更直接影响肝内病变。该宏基因组学信息与现有诊断手段（血清标志物、成像、组织病理学）在很大程度上正交，能识别CA19-9阴性和肝功能代偿期患者中的CCA病例，可作为现有诊断路径的无创补充而非替代。然而，病例对照设计中的阳性预测值（positive predictive value, PPV，检测阳性者中真正患病的概率）和阴性预测值（negative predictive value, NPV，检测阴性者中真正未患病的概率）基于高患病率人群，在真实低患病率筛查人群中PPV可能下降。此外，横断面设计无法确定因果关系，缺乏特定病因（如肝吸虫感染）分层及早期与晚期肿瘤的分期数据，且饮食和遗传背景等潜在混杂因素仍需考量。
研究结论表明，通过大规模宏基因组测序，本研究首次全面揭示了CCA患者肠道多界微生物组（包括古菌、细菌、真菌和病毒）及其功能特征（包括KO基因、KEGG通路和CAZymes）的全景图谱，并验证了一种基于多界微生物和功能标志物的集成诊断模型。该模型在多个独立队列中表现卓越，确立了一种可辅助高危人群胆管癌筛查和早期识别的无创工具，对补充现有诊断方法具有重要意义。
