通过重编程pacidamycin生物合成基因簇构建mureidomycin A高效抗铜绿假单胞菌生产平台

《Microbial Cell Factories》：Engineering a production platform for the potent antipseudomonal antibiotic mureidomycin A by reprogramming the pacidamycin biosynthetic gene cluster

　　

背景：尿苷肽类抗生素（uridyl peptide antibiotics，UPAs）对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）表现出强效活性，该病原体可导致严重医院获得性感染。四个亚类——mureidomycins、pacidamycins、napsamycins和sansanmycins——抑制研究不足的细菌靶点磷酸-MurNAc-五肽转位酶（phospho-MurNAc-pentapeptide translocase，MraY）。结构上，这些化合物含有与中心二氨基丁酸相连的3^’-脱氧尿苷。后者位于由非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase，NRPS）机制组装的假四肽或五肽部分内。亚类通过所掺入氨基酸的变异而区分。天然生产菌株通常以低产量合成多种不同的尿苷肽类抗生素。由于在相同表达系统中pacidamycin基因簇比napsamycin基因簇显示更高的总产量，研究人员旨在将其重编程为高生物活性mureidomycin A的选择性生产平台。该方法旨在简化分离过程并支持从命中到先导化合物的优化。结果：Streptomyces albus J1074被鉴定为pacidamycin基因簇异源表达最有前景的宿主。随后，进行了培养基筛选和前体喂养，并将密切相关基因簇的调控因子引入异源宿主。napsamycin基因簇NpsM调控因子的过表达显著提高产量。接下来，对pacidamycin基因簇进行工程化以产生更强效的mureidomycins。肽部分的可变位置通过非核糖体肽合成酶机制的域或模块交换分别靶向。更具体地，这些位置被napsamycin基因簇的同源物替换，导致菌株主要产生sansanmycin A或mureidomycin A。启动子工程提高了最终菌株中mureidomycin A的产量，这与在携带相同启动子的中间菌株上RNA测序（RNA sequencing）实验中转录水平增加相关。结论：通过遗传工程改造pacidamycin基因簇构建了杂合尿苷肽类抗生素基因簇，证明这些基因簇的多功能性。虽然天然pacidamycin基因簇仅产生pacidamycin D和S，最终菌株产生更具生物活性的mureidomycin A和Met-pacidamycin 5。此外，sansanmycin A（同义名 Met-pacidamycin 4）可从本研究的中间构建体中分离。这扩大了获得不同类似物的途径并突显了进一步工程化潜力，将促进这些有前景抗生素的未来开发。

论文解读：通过重编程pacidamycin基因簇构建mureidomycin A生产平台

抗菌耐药尤其是革兰阴性病原体如Pseudomonas aeruginosa、Escherichia coli和Klebsiella pneumoniae的耐药，持续威胁全球健康；自2000年以来获批的创新抗生素很少，因此亟需具有新化学骨架和新作用机制的抗菌化合物。尿苷肽类抗生素（uridyl peptide antibiotics，UPAs；含3^’-脱氧尿苷与肽骨架的抗生素）对P. aeruginosa有强效活性，并由mureidomycins、pacidamycins、napsamycins和sansanmycins四个亚类组成，均抑制细菌细胞壁合成中的磷-N-乙酰胞壁酰五肽转位酶（phospho-MurNAc-pentapeptide translocase，MraY；亦称转位酶I）。UPAs由3^’-脱氧尿苷经特殊烯酰胺键连接至中心(2S,3S)-N-甲基-2,3-二氨基丁酸（DABA），DABA位于四肽或五肽假肽骨架中心；各亚类因掺入氨基酸不同而区分。天然生产菌通常低产量合成多种UPAs，而pacidamycin BGC在相同表达系统中总产量高于napsamycin BGC，且仅含22个基因、至少5个操纵子，较29个基因、至少9个操纵子的napsamycin BGC更便于遗传操作。因此，研究人员旨在将pacidamycin BGC重编程为高生物活性mureidomycin A的选择性生产平台，以简化分离并支持hit-to-lead优化。研究人员先优化pacidamycin BGC异源表达，鉴定S. albus J1074为最佳宿主，并通过培养基筛选、调控因子过表达和前体喂养提高产量；随后用napsamycin BGC同源基因进行NRPS域/模块交换，改造UPA骨架三个可变位置，并结合启动子工程提高产量。最终构建的杂合pacidamycin/napsamycin BGC使菌株主要产生mureidomycin A和Met-pacidamycin 5，中间构建体可产生sansanmycin A（同义名Met-pacidamycin 4）。该研究证明高度解离的UPA NRPS基因簇可通过工程化实现杂合BGC构建和产物导向，扩展了不同类似物的获取途径，并为这类有前景抗生素的进一步开发和半合成衍生化提供平台。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员采用异源表达宿主筛选与接合转移，将pacidamycin BGC整合到多株Streptomyces中，并以S. albus J1074为宿主；用琼脂扩散生物测定和HPLC-ESI-MS/MS分析活性与代谢物；通过Red/ET介导同源重组、FLP重组酶和I-SceI辅助的基因/模块替换及启动子盒敲入完成基因簇工程；对中间菌株进行mRNA测序；纯化P. aeruginosa PAO1 MraY-His₆并用荧光法测定IC₅₀，按CLSI微量肉汤法测定MIC。天然生产菌S. coeruleorubidus NRRL 18370用作阳性对照；未涉及临床样本队列。

研究结果：1）优化天然pacidamycin BGC的异源表达：通过将pacNH01整合到7株Streptomyces中并用琼脂扩散法筛选，发现S. albus J1074/pacNH01抑菌圈最大，LC-MS信号也最高，且与天然生产菌相同保留时间检测到pacidamycin D（m/z 712 [M + H]⁺）和S（m/z 673 [M + H]⁺）；培养基P产量最高；NpsM过表达显著提高pacidamycin D产量，Pac1和SsaA无显著影响；l-Ala喂养略增产量，l-Trp/l-Phe无效，l-m-Tyr使pacidamycin D/S下降并出现pacidamycin T。2）在UPA骨架第4位整合l-Met：通过将pac15替换为npsP8、pac14替换为npsP4，所得菌株不再产生pacidamycin D/S，而产生Met-pacidamycin D（m/z 772 [M + H]⁺）和Met-pacidamycin S（m/z 733 [M + H]⁺），LC-MS/MS支持其在AA4掺入l-Met，但产量低于亲本。3）尝试在UPA骨架第1位整合l-Gly及转录水平研究：将pac2替换为npsN后未检测到五肽UPA，但Met-pacidamycin D/S产量高于亲本；在pac3与pac4间插入P15/P16双向启动子盒后，Met-pacidamycin D仅轻微增加且不显著，Met-pacidamycin S不受影响，仍未检测到五肽UPA；RNA测序显示基因交换降低BGC转录，而启动子盒显著提高整个BGC转录，甚至高于天然BGC。4）在UPA骨架第2位整合l-m-Tyr及正调控因子影响：敲除pac21后UPA生产消失；用pRS02补入pac21h和phhA后恢复生产，产生Met-pacidamycin 4（m/z 864.3 [M + H]⁺）、Met-pacidamycin 5（m/z 825.3 [M + H]⁺）及少量mureidomycin A（m/z 841.3 [M + H]⁺）；pRS04额外过表达NpsM后三种UPA产量显著提高。5）在UPA骨架第5位整合l-m-Tyr及启动子工程提高产量：将pac12替换为npsP3后，仅检测到Met-pacidamycin 5和mureidomycin A，且mureidomycin A信号最高；在pacRS03的pac3与pac4间插入双向启动子盒得到pacHK11后，mureidomycin A产量约提高4倍；在S. albus B2P1中，mureidomycin A产量约提高5.5倍，Met-pacidamycin 5约提高6.8倍。6）所研究UPAs的抑制活性：用纯化P. aeruginosa MraY测定IC₅₀，Met-pacidamycin 4最低（0.0016 μg/mL，0.0019 μM），其次为mureidomycin A（0.0033 μg/mL，0.0039 μM）、pacidamycin D（0.0029 μg/mL，0.0041 μM）和pacidamycin S（0.0064 μg/mL，0.0095 μM）；对P. aeruginosa PAO1的MIC为1–8 μg/mL，Met-pacidamycin 4为1 μg/mL，mureidomycin A为2 μg/mL，pacidamycin D和S均为8 μg/mL，提示AA4为l-Met较l-Ala与更强抗菌活性相关。

讨论部分总结：讨论指出，mureidomycin A和C是hit-to-lead开发的有趣候选，因为其靶向市场上抗生素未靶向的MraY；部分UPAs除胞质结合位点外还可结合MraY的周质抑制位点，有助于降低耐药发生。构效关系研究提示AA4疏水残基改善细胞摄取，四肽骨架N端AA2的l-m-Tyr增强MraY抑制，ureido-dipeptide基序对MraY抑制关键；NppA1A2BCD转运体参与3^’-羟基mureidomycin A摄取，肽骨架可能影响导入选择性。研究人员此前在S. albus J1074中表达napsamycin BGC时mureidomycin A和B合计产量低（约13 mg/L），而pacNH01表达天然pacidamycin BGC时pacidamycin D和S分别约60 mg/L和35 mg/L，故选择重编程pacidamycin BGC。前体喂养中l-Ala可提高pacidamycin产量，l-Phe/l-Trp无效，l-m-Tyr可导向pacidamycin T但产量和成本限制其作为替代方案。启动子盒P15–P16可提高转录，但未完全转化为产量，提示存在其他瓶颈；RNA测序还显示DABA生物合成操纵子转录较低。将pac2替换为npsN未产生含l-Gly五肽UPA，即使插入单方向组成型启动子仍未检测到，mureidomycin C生产仍需另行研究或半合成。研究结论翻译：UPAs是一组有前景的抗菌剂，尤其对医院获得性病原体P. aeruginosa显示强效生物活性；这些分子在骨架特定位置不同，据此分为四个亚类。虽然pacidamycins活性较低，mureidomycins尤其mureidomycin A和C对一组P. aeruginosa菌株显示强效活性。在本研究中，研究人员创建了一个生产平台，能够选择性生产mureidomycin A作为主要化合物，仅一个脱羟基类似物作为次要产物；一个中间菌株主要产生Met-pacidamycin 4（也称sansanmycin A），可作为这种对Mycobacterium tuberculosis有生物活性的抗生素来源。这是通过将pacidamycin BGC遗传工程改造为mureidomycin生产实现的。据研究人员所知，这是首次构建杂合UPA BGC；更具体地，先前产生的pacidamycins在UPA骨架所有三个可变位置（AA2、AA4和AA5）被修饰，并实现了提高化合物产量的启动子工程。因此，生物合成被成功导向具有改善生物活性的所需化合物。与天然mureidomycin/napsamycin生产菌Streptomyces sp. DSM5940相比，mureidomycin A在工程菌株中是主要化合物。虽然最具生物活性的衍生物mureidomycin C未被工程菌株产生，但mureidomycin A仅缺少N端l-Gly（R1），因此是通过半合成方法获得mureidomycin C的理想候选；同时，天然菌株中mureidomycins和napsamycins的多样性在此不存在，极大促进化合物分离纯化。这为这一有前景化合物类的进一步研究铺平道路，例如通过半合成衍生化，可能有助于进一步开发过程并潜在导向临床前研究。