《Journal of Plant Diseases and Protection》：Biscogniauxia rosacearum, first evidence in Germany and pest risk analysis for the potentially quarantine relevant charcoal canker fungus
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自Biscogniauxia rosacearum在德国首次被检测到以来，研究人员针对这种具有潜在检疫相关性的木材腐朽真菌提出了有害生物风险分析（PRA）。该物种已知分布于整个地中海地区，推测原产于中东，通常发现于蔷薇科（Rosaceae）及其他落叶树木。研究
自Biscogniauxia rosacearum在德国首次被检测到以来，研究人员针对这种具有潜在检疫相关性的木材腐朽真菌提出了有害生物风险分析（PRA）。该物种已知分布于整个地中海地区，推测原产于中东，通常发现于蔷薇科（Rosaceae）及其他落叶树木。研究人员鉴定出两个新的寄主树种：Abies grandis和Pseudotsuga menziesii。此外，研究人员将该子囊菌与在德国普遍存在的Biscogniauxia mediterranea进行比较，并基于ITS、TUB和ACT序列比对的多基因系统发育（multigene phylogeny）将其区分。此外，研究人员对选定的B. mediterranea和B. rosacearum分离菌株应用了使用先前发表的、用于检测B. mediterranea的种特异性引物组合的qPCR检测（qPCR assay），结果显示该引物组合不适合鉴定B. mediterranea，因为其特异性扩增B. rosacearum的DNA。
研究背景与问题：Biscogniauxia属约90个种名，隶属于子囊菌门（Ascomycota）炭角菌目（Xylariales）Graphostromataceae，世界分布，可寄生于多种木本植物，既可为内生菌（endophytes），也可为病原菌，常在树木受干旱等非生物因素显著削弱后造成严重木材腐朽。欧洲已知13种，德国此前已知4种：B. capnodes、B. mediterranea、B. nummularia和B. repanda。B. rosacearum推测原产中东，分布于地中海地区，通常见于蔷薇科及其他落叶树，已在意大利报道引起梨、李和榅桲的炭溃疡病（charcoal canker）；该菌具有植物检疫意义（EFSA 2022；JKI 2025），但未列入欧盟2019/2072附件，也未列入欧洲和地中海植物保护组织（EPPO）。近期该菌在德国Abies grandis和Pseudotsuga menziesii上首次发现。存在的问题是：B. rosacearum与B. mediterranea形态和培养特征难以区分；历史上部分B. rosacearum序列被误标为B. mediterranea存入数据库，造成寄主范围和地理分布认识混乱；Luchi et al. (2005)的B. mediterranea种特异性引物组合特异性存疑；德国新发现需要开展PRA。因此，研究人员旨在补充B. mediterranea、B. nummularia和B. rosacearum信息，鉴定西北德国森林研究所（NW-FVA）菌株保藏中可能未被识别的B. rosacearum，识别NCBI GenBank中可能误标的B. rosacearum条目，测试Luchi et al. (2005)引物，评估B. rosacearum已知寄主和分布范围，并按国际植物保护公约（IPPC）和EPPO标准开展PRA。
研究开展、结论与意义：研究人员于2021年和2024年在德国下萨克森州Kirchlinteln附近和萨克森-安哈尔特州Genthin附近，通过NW-FVA常规森林保护咨询和森林损害病因分析，从48年生Abies grandis病枝和30年生Pseudotsuga menziesii枯梢中分离到B. rosacearum菌株NW-FVA 6753（=2021-69-SB-Z1-112，GenBank PX239669）和NW-FVA 13169（=2024-73-ü1–2，GenBank PX239675）；两株均与其他真菌或病原共存，原文未显示B. rosacearum是初侵染病原，且尚未进行致病性试验，Koch氏法则（Koch’s postulate）在两种树中均未满足。比较菌株包括来自Pseudotsuga menziesii、Quercus petraea和Fagus sylvatica的B. mediterranea德国菌株。研究结论是：两株德国菌株为B. rosacearum；Luchi et al. (2005)引物/探针组合实际扩增B. rosacearum而非B. mediterranea，不宜用于鉴定B. mediterranea；GenBank中存在应归B. rosacearum而原标为B. mediterranea的ITS条目；PRA提示B. rosacearum分布范围可能远大于已知，并可能在德国及南欧/地中海欧盟成员国定殖。其意义在于首次提供德国证据，纠正诊断和数据库误标，并为该潜在检疫性真菌的风险评估提供依据。
关键技术方法：样本来源为德国2021年Abies grandis（下萨克森Kirchlinteln附近）和2024年Pseudotsuga menziesii（萨克森-安哈尔特Genthin附近）病树，以及NW-FVA菌株保藏和GenBank序列。研究人员对ITS、TUB和ACT进行扩增测序，构建多基因序列分析（MLSA）和最大似然（ML）系统发育树，并以B. rosacearum ex-type CBS 141,046（GenBank KT253493）进行Blastn筛选；采用Luchi et al. (2005)引物/探针组合进行qPCR检测；按IPPC、EPPO和欧盟标准开展Express-PRA（快速有害生物风险分析）。
研究结果：（1）Additional information on B. mediterranea, B. nummularia, and B. rosacearum：通过形态观察和PDA培养比较，展示Biscogniauxia有性型（teleomorph）和无性型（anamorph）及症状；B. nummularia子座（stroma）在树皮下形成垫状真菌团，致树皮剥落，木材腐朽致脆裂；B. mediterranea与B. rosacearum在PDA上无可辨培养差异，但种内培养外观有变异。（2）Molecular identification and phylogenetic analysis：通过ITS、TUB、ACT多基因MLSA和ITS Blastn，NW-FVA保藏中除两株外无其他B. rosacearum；两株德国菌株聚入B. rosacearum支，6株B. mediterranea聚入B. mediterranea支；两物种形成支持良好的独立单系支；GenBank中多数应归B. rosacearum的ITS序列原被标为B. mediterranea。（3）qPCR analysis：通过Luchi et al. (2005)引物/探针qPCR，B. rosacearum两株阳性（NW-FVA 6753：Ct mean±SD=17,92±0,06，ΔRn mean=5,119；NW-FVA 13169：17,34±0,03，5,222），B. mediterranea菌株和无模板对照（NTC）无信号；结论为该组合实际扩增B. rosacearum，不适合鉴定B. mediterranea。（4）Express pest risk analysis：通过按IPPC/EPPO/EU标准的Express-PRA得出：Biology of the organism：Biscogniauxia通常为机会性病原和内生菌，干旱影响B. rosacearum攻击性，形成子座，高繁殖率、异宗配合（heterothallic），先产分生孢子（conidia），后产子囊孢子（ascospores），风、昆虫、水或动物传播，两种孢子均可侵染。Geographical distribution of the fungus and areas infested：除德国两例，已知伊朗、意大利、葡萄牙、西班牙、南非和突尼斯；ITS系统发育提示更大分布（北非、中东、南欧至中欧、中国、美国），但欧盟仅零星确认，需调查。Host plants and their presence in the PRA area：已知梨、李、榅桲、Quercus pubescens、葡萄（温室致病试验确认）、Q. castaneifolia、Q. infectoria、Q. libani、Q. brantii、Prunus dulcis、Arbutus unedo、Myrtus communis（与Diaporthe foeniculina共感染）、Olea europaea等；Raimondo et al. (2016)还列Platypus cylindrus、Holcus lanatus、Q. ilex、Pinus sylvestris；EFSA (2022)提P. sylvestris但无进一步证据；德国新寄主为Abies grandis和Pseudotsuga menziesii；ITS Blast提示更广寄主包括Q. cerris、Q. faginea、Q. ilex、Q. robur、Q. suber、P. mugo、P. nigra、P. pinaster等；多数在德国和欧盟具经济生态重要性。Symptoms：葡萄接种2周后叶黄化坏死，茎上下褐色病斑，横切呈楔形维管组织坏死；梨、李、榅桲茎皮出现charcoal-like canker。Climate in distribution area and PRA area：地中海和南非可靠检出，德国两例显示中欧也可能适合；GenBank提示中国和美国但未核实。Pathways and natural spread：种植植物为主要途径；自然传播靠风或昆虫。Known impacts in infested areas：Biscogniauxia为内生菌、次生病原和兼性腐生菌，老弱树在干旱时发病，快速定殖木质部和树皮，造成坏死和溃疡，严重致死；年轻健康树也日益感染；B. rosacearum中植物毒素（phytotoxins）起重要作用。Expected (further) establishment and spread in Germany and the EU：德国已有两例，高繁殖和风/虫传播，推测可能已更广；欧盟南部有证据，预计进一步定殖。Expected impacts caused by the fungus in Germany and the EU：气候适宜区对已受干旱或其他有害生物削弱的寄主可显著损害；但德国两树中B. rosacearum可能不是观察损害原因。Detection and diagnosis：形态难辨，PDA培养无显著区别；ITS可明确鉴定，MLSA确认；历史误标致比较混乱；Luchi et al. (2005) qPCR可误判；无症状潜伏感染检测困难。Eradication of an infestation：无已知杀菌剂控制；唯一有效为砍伐和销毁（焚烧）感染寄主，仅未广泛分布时有用；需确定无侵染区及内生无症状情况；城市农业区改善树势（减少压实、覆盖、灌溉、施肥），去除明显感染枝以减少接种体和防树折；欧盟零星、德国两例，需调查。
讨论总结：Raimondo et al. (2016)表明两种可用微形态区分，子囊和子囊孢子大小不同，但无性型区分模糊；B. mediterranea形成periconiella-like anamorph，B. rosacearum形成nodulisporium-like anamorph；需大量不同地点和寄主分离株的比较形态研究。Henriques et al. (2015)发现B. mediterranea无性型结构变异大，但其中部分可能属于B. rosacearum；有性型通常在基质上而非培养中产生，若仅有纯培养不能仅凭培养特征区分，需ITS分子信息；MLSA三基因可鉴定新培养物并识别GenBank错误条目；参考序列质量重要。
研究结论翻译：该研究成功实现了引言中提出的目标。研究表明，在NW-FVA菌株保藏中最初只能归入Biscogniauxia属的真菌菌株可鉴定为B. rosacearum。研究表明，Luchi et al. (2005)发表的B. mediterranea种特异性引物可能导致检测结果误判，因为所用特异性引物/探针组合扩增的是B. rosacearum而非B. mediterranea。因此，现在可以识别NCBI GenBank数据库中此前未被鉴定的B. rosacearum条目。在PRA中，结合这些关于两种Biscogniauxia物种鉴定和区分的新结果，可显示B. rosacearum的分布范围远大于此前已知。此外，PRA假设由于气候条件适宜和潜在寄主存在，B. rosacearum可在德国定殖；预计其将在南欧和地中海欧盟成员国进一步定殖。因此，更详细评估该真菌定殖和扩散所需气候条件，并结合其扩散潜力建模，将有助于更好估计其对欧洲现有寄主的风险。B. rosacearum对某些蔷薇目（Rosales）和栎属（Quercus）植物具有高损害潜力，引起炭溃疡病（charcoal canker）。迄今未在其他寄主植物中观察到charcoal canker的发展，因此研究这些物种是否可满足Koch氏法则很重要。此外，关于不同B. rosacearum菌株对不同寄主物种的系统发育多样性和致病性信息不足。在其他树种中，该真菌似乎不造成损害，仅以内生或机会性方式存在。B. rosacearum与B. mediterranea的混淆进一步使问题复杂化，因为两种不同物种的寄主植物和影响及其当前分布归属可能存在错误。由于这些不确定性，在研究现阶段无法最终评估B. rosacearum的植物检疫风险。因此，迫切需要进一步研究，也最终确定该真菌是否有资格作为欧盟潜在检疫性有害生物。
