整合标记辅助回交育种与ddRAD基因组分析创制耐热鲜食番茄新基因型

《Molecular Breeding》：Integrating marker-assisted backcross breeding and genomic analysis to obtain thermotolerant tomato genotypes for the fresh market

　　

当前气候变化显著影响农业，对包括番茄在内的许多农作物的生长和发育产生负面影响。为适应当前温度升高，开发新型耐热栽培品种至关重要。本研究描述了一个回交育种计划，旨在产生适合鲜食番茄市场的新基因型，这些基因型表现出先前筛选的耐热基因型E42的有利特征。这是通过将E42的有限生长型（determinate habit）转变为无限生长型（indeterminate habit）实现的。针对自封顶基因（self-pruning gene, SP）中单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）设计的SP_CAPS标记决定株型，使研究人员能够加速选择无限生长型植株，从而获得9个BC₄S₁株系。在两种生长条件（露地，open field, OF；塑料大棚，plastic tunnel, PT）下评估10个表型性状，表明BC₄S₁株系表现良好，且所有株系均表现出轮回亲本（recurrent parent）的表型恢复。有趣的是，一个基因型在露地栽培时超过该组平均产量值。此外，双酶切限制性位点相关DNA测序（double digest restriction-site associated DNA sequencing, ddRAD）数据分析显示高水平的基因组恢复，仅保留少量来自供体亲本的变异。几乎所有BC₄S₁株系在通过标记辅助选择（marker-assisted selection, MAS）靶向的自封顶基因周围均检测到明显的连锁累赘（linkage drag）。总之，本工作提供了具有高果实品质的改良耐热基因型，可能适用于番茄鲜食市场。

论文主体内容解读：番茄是全球重要蔬菜，鲜食市场与加工市场对株型和采收方式要求不同。鲜食市场通常需要无限生长型以利分期采收，而有限生长型常适合同期机械采收。当前气候变化导致高温胁迫（heat stress, HS）在生殖阶段频发，引起落花、雌雄蕊发育受损、花粉萌发差和产量损失。研究人员前期筛选出耐热基因型E42，其产量和果实品质优良，但有限生长型（determinate habit）不适合鲜食市场。为将E42用于鲜食市场并保持其他优良性状，该研究开展标记辅助回交（marker-assisted backcross, MABC），以前景选择自封顶基因（self-pruning gene, SP）的显性等位基因Sp，将E42有限生长型转为无限生长型（indeterminate habit），并评价BC₄S₁株系在露地（open field, OF）和塑料大棚（plastic tunnel, PT）高温条件下的表型、生理和基因组恢复。其意义在于获得兼具耐热性和高果实品质的鲜食番茄预育种材料。

关键技术方法：以轮回亲本E42与来自University of Naples Federico II农业科学系番茄种质收集的5个无限生长供体PL1–PL5进行杂交，2021年夏开始，2022—2023年每年两代回交至BC₄，2023年8月获BC₄，2024年3月自交选BC₄S₁；在意大利Acerra的OF和PT条件下评价10个表型性状及量子产额（quantum yield, QY）、H₂O₂、丙二醛（malondialdehyde, MDA）和总酚含量（total phenolic content, TPC）；用SP_CAPS标记进行前景选择，用ddRAD测序进行背景选择。

研究结果：
1. 标记辅助回交：研究人员设计SP_CAPS标记靶向SP第二外显子SNP（43,636,571 T/C），PCR扩增539 bp，BstNI消化后无限型产生109 bp和430 bp片段，有限型为539 bp；该标记用于F₁和回交后代筛选。除E42-10的BC₂后代可能因种子批次污染而全部为有限型并被淘汰外，各回交后代均符合1:1分离预期，最终获得9个BC₄S₁株系。
2. BC₄S₁后代的表型评价：2024年夏季OF和PT白天最高温分别平均为37.3 °C和42.1 °C，日均温约32.5 °C和33.9 °C，夜温高于21 °C。9个株系产量相关性状中NFL、FW和YP较稳定，YP通常高于2 kg/plant，E42-7在OF达3.3 kg/plant且显著较高；FS和TNF存在范围变化。品质性状TSSC约6 °Brix、TA约0.5、pH约4.5、硬度高于15 N，果面积有变异。结论为BC₄S₁株系在高温下表现良好并保持果实品质。
3. 高温下的生理与生化响应：OF中QY多在0.7–0.8，PT下多数BC₄S₁株系QY稳定或升高，E42和E42-6除外，表明高温未造成普遍PSII光化学损伤；H₂O₂、MDA和TPC呈基因型依赖变化，部分株系在PT下较低或不变，部分升高，TPC在部分株系中升高。结论为株系保留耐热相关生理特征但生化响应策略不同。
4. BC₄S₁后代的表型恢复评估：基于10个表型性状的主成分分析（principal component analysis, PCA）显示，几乎所有BC₄S₁株系在两种环境下均与E42聚类，供体亲本多位于聚类圈外；E42-7在OF下例外。结论为BC₄S₁株系具有高表型相似性。
5. BC₄S₁后代的基因组恢复评估：ddRAD数据获得532,412个高质量变异，E42与供体亲本分歧为21.4%–34.1%；BC₄S₁中大多数父母间无多态（60.8%–79.3%），父母间SNP仅0.01%–0.74%仍来自供体，表明轮回基因组高恢复。供体特异变异少量分布于1、4、6和7号染色体；6号染色体SP区（43,636,031–43,638,303）中E42-3、E42-6和E42-9保留供体等位，E42-1、E42-7和E42-9在基因上游保留供体多态，E42-2、E42-4和E42-5未检测到供体SNP。注释到Solyc06g074270（FAF）、Solyc06g082730（细胞色素P450）、Solyc06g070950（ABC转运蛋白）、Solyc06g071300（AGAMOUS-like 98）和Solyc06g072650（SAUR61）等候选基因；E42-7在1号和4号染色体的供体片段与产量、果数和坐果数量性状位点（quantitative trait loci, QTL）共定位。结论为基因组高恢复但存在连锁累赘，部分供体片段可能带来有利性状。

讨论部分指出，MABC可加速前景选择并减少种植数量；BC₄S₁株系在高温下保持产量和品质，E42-7在OF下产量更高。由于供体均为栽培背景且已筛选耐热和果实品质，研究人员未进行重组选择以削减连锁累赘，而关注供体片段中可能有利的等位变异；候选基因预测功能涉及花发育、激素运输、次级代谢和胁迫响应，仍需功能验证。研究结论部分翻译如下：本研究使研究人员能够将先前筛选的耐热、高果实品质E42基因型适配鲜食番茄市场。总体而言，工作聚焦于将耐热有限型E42转为无限型。研究人员将SP位点的前景选择整合到MABC方法中，并结合详细表型评估和基于ddRAD的基因组分析，对在OF和PT下种植的先进BC₄S₁株系进行分析。所得株系很大程度上恢复E42表型，保持高水平轮回基因组，并在高温条件下表现出稳定的产量和果实品质相关性能。然而，这些结果应视为初步结果，需要额外多环境、多年试验验证，以确认所选BC₄S₁株系在不同生长条件下的农艺性能和稳健性，其中鉴定出表现更优的E42-7株系。这表明改变株型并未损害最初促使选择E42的理想特征。因此，这些BC₄S₁株系是适应地中海类似环境的鲜食市场樱桃番茄或小果番茄的有价值预育种材料。它们可直接作为F₁杂种开发的亲本，也可作为兼具耐热性和果实品质的供体。还需强调，ddRAD分析揭示的供体基因组残留部分，无论因连锁累赘还是位于其他染色体，均为BC₄S₁株系引入了超出E42的额外有利性状。事实上，供体均为栽培基因组株系，先前已筛选出耐高温和良好果实品质。对这些与BC₄S₁株系良好表现相关的供体区域的研究，鉴定出对特定性状有利等位基因的候选基因。未来，功能表征本研究中鉴定的候选基因将很重要，以更好阐明其在观察到的表型变异中的潜在作用。