褪黑素信号扰动调控拟南芥光氧化胁迫下的呼吸作用与线粒体基因表达

《Russian Journal of Plant Physiology》：Perturbation of Melatonin Signaling Modulates Respiration and Mitochondrial Gene Expression in Arabidopsis thaliana During Photooxidative Stress

褪黑素（Melatonin, MT）是线粒体的关键调控因子，影响生物能量代谢、动力学及基因表达，并能有效保护线粒体免受氧化胁迫。本研究阐明了 putative 褪黑素受体 CAND2/PMTR1 在高光（high light, HL）胁迫下对线粒体呼吸以及褪黑素介导的线粒体基因表达的作用。在拟南芥中破坏 CAND2 及其互作伴侣 GPA1，导致呼吸速率升高，且主要以细胞色素呼吸途径（cytochrome respiration, CP）为主；而野生型（wild type, WT）植株和 35SCAND2 过表达株系则以交替呼吸途径（alternative respiration, AP）的增强为主。MT 处理降低了 HL 胁迫下 AP 的激活程度，并降低了叶片总体呼吸速率，然而这些效应在 cand2 和 gpa1 突变体中较弱。HL 胁迫下 AP 能力的增加与交替氧化酶（alternative oxidase, AOX）基因（AOX1a, AOX1d）转录本积累的增加呈正相关。同时，在胁迫条件下，所研究的 CP 相关基因（cob, cox1）和 ATP 酶基因（atp6-1）的表达受到抑制。MT 处理完全消除了这种抑制，但仅在 WT 和 35SCAND2 植株中如此。此外，cand2 突变体表现出与线粒体功能障碍相关的基因稳态转录水平升高，提示该突变体处于初始胁迫状态。外源褪黑素对线粒体基因活性的影响主要依赖于 CAND2 受体活性，尽管部分基因受褪黑素调控但不依赖 CAND2，表明植物中褪黑素感知存在多种机制。因此，MT 信号的破坏对线粒体呼吸和线粒体基因表达具有显著影响。

**褪黑素信号扰动调控拟南芥光氧化胁迫下呼吸作用与线粒体基因表达的研究解读**

**一、研究背景与科学问题**

褪黑素（N-acetyl-5-methoxytryptamine, MT）是一种在动物和植物中均发挥重要生理功能的吲哚胺类物质。在植物中，MT不仅参与种子萌发、果实发育和成熟等生长发育过程，还作为内源性活性氧（reactive oxygen species, ROS）清除剂发挥抗氧化功能。已有证据表明，外源MT能够保护植物免受极端温度、干旱、盐胁迫等多种非生物胁迫的危害。尽管近年来哺乳动物中褪黑素与线粒体的关系已被广泛研究，但关于MT对植物线粒体呼吸分子调控的研究仍十分有限，尤其在胁迫条件下。鉴于线粒体呼吸速率的调节对植物生长和环境适应至关重要，线粒体被认为是MT缓解胁迫损伤的主要靶标之一。已有报道表明，MT可影响苹果幼苗涝害条件下的呼吸代谢、延缓采后蔬菜衰老、抑制香蕉乙烯合成并降低呼吸速率。Turk等人发现，MT预处理玉米叶片可提高总体线粒体呼吸速率以及细胞色素途径（cytochrome pathway, CP）和交替途径（alternative pathway, AP）的速率。在拟南芥中，MT在适宜条件下抑制AOX基因表达而上调线粒体电子传递链（electron transport chain, ETC）复合体基因；在光氧化胁迫下，主呼吸链基因表达下调，而保护ETC免受ROS过度形成的基因（AOX1a, NDB2）被激活。MT施用通过降低AP能力抑制叶片呼吸，并与AOX基因转录积累的抑制相关。目前，植物中已鉴定到一个质膜定位的褪黑素受体CAND2/PMTR1，其与G蛋白α亚基GPA1偶联，触发下游H2O2信号。已有研究表明PMTR1参与调控种子萌发、叶片衰老、抗旱性及高光耐受等过程。然而，CAND2/PMTR1在褪黑素调控线粒体呼吸及线粒体基因表达中的作用尚不清楚。为此，研究人员利用拟南芥cand2和gpa1突变体及35SCAND2过表达株系，系统分析了MT信号通路在光氧化胁迫下对线粒体呼吸和线粒体基因表达的影响。

**二、研究方法概述**

研究人员以拟南芥哥伦比亚生态型野生型（WT）、T-DNA插入突变体cand2-1和gpa1以及CAND2过表达株系35SCAND2为材料。植株先在1/2 MS培养基上生长两周，然后转移至含50 μM MT或不含MT的液体培养基中处理三天，随后进行高强度光胁迫（600 μmol photon m^?2 s^?1）24小时，对照保持低光条件。呼吸速率采用Clark型氧电极极谱法测定，通过添加KCN（抑制细胞色素氧化酶）和SHAM（抑制交替氧化酶）区分总呼吸（Vt）、交替呼吸（AP/Valt）、细胞色素呼吸（CP/Vcyt）和残余呼吸（Vres）。基因表达分析采用Trizol法提取RNA，经DNase I处理后反转录合成cDNA，使用实时定量PCR（qRT-PCR）检测目标基因转录水平，以UBQ10为内参基因，每个反应设三次重复，并用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验进行统计分析。

**三、主要研究结果**

**1. MT信号突变体中叶片呼吸的AP/CP比值发生改变**
抑制分析结果显示，野生型拟南芥叶片在正常光照下，交替呼吸途径（AP）的最大能力约占总呼吸的40%，细胞色素途径（CP）占35%–45%，残余呼吸占15%–25%。外源MT（50 μM）轻微增强CP活性，同时抑制AP和残余呼吸。高光胁迫显著增加总体呼吸速率，主要通过激活AP途径。MT处理降低高光下AP的激活并降低总体呼吸速率。然而，在cand2突变体中，AP活性在正常条件下降低，高光导致的呼吸激活程度弱于野生型，且CP速率增加，并且MT处理不能降低CP。在gpa1突变体中，AP水平始终较低，但CP速率补偿性升高，胁迫下呼吸增加主要依赖CP，且MT处理对两个参数均无影响。35SCAND2过表达株系的呼吸参数对高光和MT处理的响应与野生型相似。这些结果表明CAND2和GPA1偶联参与了MT信号对拟南芥叶片线粒体呼吸的调控。

**2. MT信号通路突变不影响胁迫下AP相关基因和NDB3基因表达，但参与外源MT的调控**
在高光胁迫下，野生型、cand2和gpa1植株中AOX1a和AOX1d基因表达约增加2倍，而在35SCAND2中基本不变。MT处理显著下调野生型中这两个基因的表达（AOX1d恢复至对照水平），但对cand2和gpa1无影响。对于NADH脱氢酶基因，转录组和qRT-PCR数据显示，NDB3基因在野生型中受HL诱导，且HL+MT处理使其表达下降，但在MT感知缺陷突变体中MT不能抑制NDB3表达；在35SCAND2中NDB3不受胁迫或MT影响。这表明MT对AOX和交替NAD(P)H脱氢酶的调控依赖CAND2。

**3. 细胞色素途径相关基因受高光胁迫和MT信号突变差异调控**
尽管CP途径呼吸显著激活，光氧化胁迫却导致线粒体编码的复合体I亚基基因（nad3, nad6）、复合体III（cob）、复合体IV（cox1）和ATP合酶基因（atp6-1）转录水平下降。在MT+HL联合处理下，这些基因在WT和35SCAND2中的转录水平相对于HL处理升高，但在cand2和gpa1中无变化。相反，核编码的复合体II基因SDH2-3在HL下表达增强，在HL+MT下表达下降，且该响应在cand2和gpa1中消失。细胞色素c基因CYTC-2在HL下被诱导，而HL+MT使其下调，且依赖CAND2；CYTC-1在两种信号缺陷突变体中稳态表达水平比野生型低两倍，可能指示线粒体功能障碍。COX17基因在高光下被诱导，但在35SCAND2中诱导较弱，MT处理不影响其表达。

**4. TCA循环相关基因在高光胁迫下对MT的响应具有基因特异性**
与Turk等人报道的MT提高玉米TCA循环酶活性不同，本研究中丙酮酸脱氢酶E1α亚基基因（PDH-E1 alpha）、线粒体苹果酸脱氢酶基因（mtMDH2）和柠檬酸合酶基因CSY4的表达不受MT处理影响。只有CSY5在WT和35SCAND2中受HL下调并被MT恢复；在cand2中CSY5稳态水平降低，但HL胁迫下被激活，MT处理后下降，表现出不依赖CAND2的调控。这表明TCA循环相关基因受MT以基因特异方式调控。

**5. MT感知受损影响线粒体特异性功能障碍基因的表达**
线粒体功能障碍标志基因COX19（编码细胞色素c氧化酶样19蛋白）在未处理的cand2和gpa1突变体中转录水平增加2倍以上，胁迫下降低。MT处理不影响WT和突变体中的COX19表达，但在35SCAND2中，HL诱导COX19表达，HL+MT部分抑制，说明CAND2表达水平影响胁迫耐受性，但COX19并非直接通过CAND2-GPA1通路调控。另一标志基因HSP23.6-MITO（编码线粒体定位小热激蛋白23.6）在高光下表达增加，在MT+HL处理下所有材料中均显著下降，表明存在不依赖CAND2的MT调控途径。此外，cand2突变体中多个三角状五肽重复（PPR）蛋白基因（SLG1, MEF9, COD1）的稳态转录水平是野生型的2倍。MEF9在WT和gpa1中受外源MT影响，但在cand2和35SCAND2中无响应；SLG1和COD1表达不受MT调控。这些结果提示cand2突变体可能处于线粒体功能受损的应激状态。同时，编码呼吸爆发氧化酶同源物（RBOH）的基因在cand2和gpa1突变体中高表达（如gpa1中RBOHF为野生型4倍），但对MT或光氧化胁迫不敏感。

**四、结论与意义**

本研究通过比较野生型、cand2、gpa1突变体及35SCAND2过表达株系在不同条件下的呼吸参数和基因表达，揭示了MT信号通路对拟南芥光氧化胁迫下线粒体呼吸和线粒体基因表达的重要调控作用。研究表明，MT信号感知受损导致线粒体AP氧化能力降低和CP活性升高，改变了AP/CP呼吸比例，并使植株对MT的呼吸调节作用不敏感。CAND2/PMTR1与GPA1偶联参与MT对交替氧化酶基因、交替NAD(P)H脱氢酶基因以及多条线粒体基因的调控。同时，部分基因（如CSY5、HSP23.6-MITO、COX19）的MT调控不依赖CAND2，提示植物中存在多重MT感知机制，可能包括受体样激酶（receptor-like kinase, RLK）等其他候选受体。cand2突变体中多种线粒体功能障碍标志基因的组成性高表达表明，褪黑素信号受损本身即使突变体处于一种初始胁迫状态。这些发现为理解植物褪黑素信号在调节线粒体功能与逆境适应中的复杂网络提供了新的证据，对改善作物抗逆性具有潜在应用价值。