《Advanced Biotechnology》：Strain engineering of Aspergillus species for industrial enzymes bioproduction: a comprehensive review
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丝状真菌曲霉属（*Aspergillus*）因其卓越的分泌能力和代谢多样性，已被广泛应用于传统食品发酵和工业生物技术领域以生产多种生物制品。其长期的驯化和工业应用历史推动了酶生产领域的重大进展；然而，与丝状生长特性及菌株工程相关的挑战在面向未来生物制造发展
丝状真菌曲霉属（*Aspergillus*）因其卓越的分泌能力和代谢多样性，已被广泛应用于传统食品发酵和工业生物技术领域以生产多种生物制品。其长期的驯化和工业应用历史推动了酶生产领域的重大进展；然而，与丝状生长特性及菌株工程相关的挑战在面向未来生物制造发展时依然存在。本文综述了菌种改良方法学的全谱系进展，涵盖从经典诱变、原生质体融合、基因组重排（genome shuffling）和适应性实验室进化（ALE），到CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）介导的基因组编辑、合成生物学及系统级代谢工程等现代阶段。此前的综述主要聚焦于单一曲霉属物种、特定工业产品或某一特定菌株改良途径。本文则对广泛应用于工业酶生产的多种曲霉属物种所涉及的经典与现代菌株工程技术及工业规模放大进行了全面概述。特别值得关注的是，诸如常压室温等离子体（ARTP）诱变等新兴非转基因（non-GMO）进化工具，以及与现代分子生物技术相结合的微液滴超高通量筛选技术，使得研究人员如今能够以单细胞精度生成并筛选大量曲霉属突变体。菌种创新加速了具有增强分泌能力、胁迫耐受性、底物利用能力以及适用于食品与生物加工应用的优良酶学特性的高性能菌株的发现。总体而言，这些进展使米曲霉（*A. oryzae*）及相关物种成为日益可靠、可放大且可编程的宿主，能够满足未来循环与可持续生物经济对生物制造的需求。
# 四、主体内容学术总结
**引言**
丝状真菌曲霉属已构成工业生物技术的基础逾一个世纪，是最早且最成功的微生物驯化用于大规模生物生产的范例之一。1917年James Currie证实黑曲霉（*A. niger*）是柠檬酸的高效生产者，奠定了全球发酵工业的基础，至1920年已实现商业化规模生产。真菌来源的酶，尤其是米曲霉（*A. oryzae*）、酱油曲霉（*A. sojae*）、黑曲霉、黄曲霉（*A. flavus*）、烟曲霉（*A. fumigatus*）和土曲霉（*A. terreus*）等多种曲霉属物种所产生的酶，占全球工业酶市场的主要份额，并因在食品、饲料、洗涤剂、生物燃料和纺织工业中的广泛用途而持续增长。这些进展在很大程度上归因于曲霉属卓越的分泌能力，其天然产生多种对生物质生物炼制至关重要的水解酶。曲霉属的驯化发生于多样的地理与文化背景中。在东亚，米曲霉和酱油曲霉等曲霉（koji mold）数百年来被用于将大米、大豆和小麦发酵为酱油、味噌和清酒等传统食品，并逐代选育以提高固态发酵中蛋白酶和淀粉酶产量。除传统应用外，米曲霉还针对工业食品发酵进行了显著优化，近期以佛山海天味业为代表的研究聚焦于改造具有改良淀粉酶、谷氨酰胺酶、蛋白酶和氨肽酶活性的菌株，以提升酱油发酵效率与风味品质；混菌发酵增强酶活与风味，体现了从传统菌株筛选向功能驱动育种（function driven breeding）的转变。相较之下，西方生物工业应用主要采用黑曲霉生产柠檬酸及淀粉加工用酶（如葡糖淀粉酶）；土曲霉用于生产洛伐他汀和衣康酸，烟曲霉和构巢曲霉（*A. nidulans*）则作为真菌模型。安全性是真菌食品工业应用物种选择的关键问题：米曲霉因不产黄曲霉毒素被列为公认安全（GRAS），而其近缘种黄曲霉的许多菌株产生环匹阿尼酸和黄曲霉毒素，不适用于食品应用，这推动了基于基因组的现代努力以消除工业曲霉菌株中残留的毒素生物合成途径。曲霉属基因组相对较大（30–37 Mb），富含分泌酶、碳水化合物活性酶（CAZymes）及次生代谢产物生物合成基因簇。米曲霉RIB40为2005年完成测序的参考菌株，其基因组研究表明其分泌酶和代谢物基因簇范围广于近缘丝状真菌，提示其对固态发酵的进化适应；其产生包括Taka淀粉酶A在内的多种α-淀粉酶、蛋白酶和糖苷水解酶，支撑其强大的胞外酶和工业蛋白分泌能力。与烟曲霉和构巢曲霉相比，米曲霉编码显著不同的更多分泌水解酶基因。因此，米曲霉及其近缘菌株借助gpdA、tef1及工程化AmyB变体等强表达启动子，被广泛用于葡糖淀粉酶、生物炼制酶和异源蛋白的生产，并因其易遗传操作和GRAS特性成为有前景的细胞工厂。黑曲霉同样表现出由长期驯化和选择性育种塑造的谱系特异性特征：传统葡糖淀粉酶生产菌株经优化以获得高效产酶、耐酸性和更高生产力；而泡盛曲霉（*A. luchuensis*）等其他"黑曲霉群"则因高产柠檬酸和适应酸性发酵环境而被选育。比较基因组学和转录组学研究表明，近缘亚谱系在转运蛋白、分泌酶谱和调控机制上可存在显著差异，主要取决于其驯化历史和发酵条件。因此，现代菌株工程策略日益利用这些谱系特异性特征，如酱油曲霉中amyB多拷贝整合及野生型菌株中转录阻遏物的靶向缺失。总体而言，比较菌株分析表明近缘曲霉谱系间的功能差异主要由基因剂量和调控控制的变异驱动，而非获得全新酶功能。本文概述经典与现代菌株改良策略的发展，包括诱变、原生质体融合、适应性实验室进化、基因组重排、基于CRISPR的编辑、合成生物学框架及新兴高通量微流控筛选技术；所构建的整合框架将经典与现代菌株改良与高通量筛选、基因组学与多组学表征、工业验证及迭代菌株改良循环相联系，旨在突出曲霉菌株底盘开发用于可持续下一代绿色生物制造的最新进展、挑战与未来展望。
**曲霉属物种及其酶学资源**
多种曲霉属物种是工业酶生产的强大宿主，各自受生态适应、进化分化和数百年人类定向驯化塑造。这些真菌拥有庞大的CAZymes、蛋白酶、脂肪酶和辅助代谢蛋白资源，可高效降解复杂有机底物。其中，用于东亚传统食品发酵的驯化曲霉米曲霉经广泛选择而具强淀粉水解和蛋白水解能力；尽管其保留黄曲霉毒素生物合成基因簇同源物，但由于关键途径基因的突变、缺失和表达丧失，在工业菌株中呈非功能性，从而贡献其食品安全地位。酱油曲霉为与Flavi组密切相关的驯化曲霉，同样经大豆发酵选择；比较基因组分析揭示米曲霉与酱油曲霉在CAZymes上的差异，可能贡献其不同的酶学特性。黑曲霉是最具价值的工业物种之一，在低pH发酵环境下大量产生酸稳定水解酶和柠檬酸，并天然分泌纤维素酶和半纤维素酶（包括木聚糖酶和内切葡聚糖酶），在生物质转化、动物饲料改良和生物燃料生产中发挥重要作用。这些物种特异性谱系构成了按所需生物技术应用选择合适工业宿主的基础。在曲霉谱系中，驯化曲霉展示了长期选择如何影响真菌产酶和发酵性能。尽管酱油曲霉与米曲霉遗传上近缘，二者酶谱不同且似遵循不同驯化轨迹：基因组比较显示米曲霉与*A. aflatoxiformans*或*A. minisclerotigenes*的亲缘关系比与黄曲霉更近，而工业菌株酱油曲霉与寄生曲霉（*A. parasiticus*）更近。虽然两者均不产黄曲霉毒素，但米曲霉保留更广泛的淀粉水解基因，贡献其优越的淀粉降解能力。在产酶和食品发酵驯化过程中，米曲霉菌株逐步被选择以获得改善的水解酶活性、高效生长和发酵性能，这些表型通过长期菌种选育中的突变积累而形成；用于味噌和酱油发酵的菌株则被选择以在蛋白密集环境中高效生长和产酶，并在高盐条件下具有改善的表现，从而获得改良的蛋白水解效率和发酵胁迫耐受性。例如，米曲霉3.042（AS3.951）是在中国驯化的、中国发酵工业中最具影响力的酱油菌株之一，该菌株于20世纪50年代末通过紫外诱变开发并在全国广泛采用，因其生长稳定、水解酶产量高且适合中国大规模酱油发酵而成为工业标准；与其他局限于个别厂商的工业菌株不同，米曲霉3.042实现了全国性应用，在标准化中国酱油生产中发挥关键作用。基因组测序和比较基因组分析揭示了与改善产酶、环境适应性和发酵性能相关的不同遗传特征，使其成为理解工业驯化分子基础和现代菌株开发的模型。近期研究表明，驯化曲霉与野生型近缘种间的差异主要源于基因拷贝数变化、转录调控、染色体重排和蛋白分泌途径的改变，共同贡献工业性状的改善；拷贝数、基因组组织和水解酶基因（包括葡糖淀粉酶和α-淀粉酶编码基因）调控的变化，贡献了特定谱系产酶能力的提升。这些基因组和生理适应共同改善蛋白分泌、底物利用效率、发酵稳健性和整体工业生产力，显示驯化和工业选择如何驱动曲霉属的功能特化，形成针对特定发酵和生物技术应用优化的独特谱系。此外，其他曲霉属物种也具有不同工业应用的多样酶谱：土曲霉是生产洛伐他汀的重要工业物种，已经过菌株筛选和遗传工程改良；构巢曲霉虽不常用于工业，但仍是真菌遗传学、调控机制和次生代谢的关键模型；土曲霉及相关物种的比较基因组分析揭示CAZymes谱和生物质降解潜力的显著差异。曲霉属CAZymes谱的多样性反映其对不同生态位的适应，并决定其工业生物质转化的底物利用能力。此外，构巢曲霉和烟曲霉的基因工程菌株已显示出强大的异源酶生产能力，因其强分泌系统和成熟的遗传技术而成为合成重组酶、药物和其他高价值蛋白的有效表达平台。总体而言，曲霉属的代谢多样性为开发针对多样工业应用的专用微生物细胞工厂提供了广泛的遗传和生化资源。
**曲霉属所产酶的工业应用**
曲霉属所产酶因高生产能力和多样催化能力而广泛用于食品加工、制药、生物燃料生产和环境生物技术。在饮料和食品工业中，米曲霉的葡糖淀粉酶和淀粉酶广泛用于生物乙醇、清酒和酱油生产中的糖化和液化；米曲霉和黄柄曲霉（*A. flavipes*）产生的蛋白酶分解乳蛋白，释放具有抗高血压和抗微生物特性的生物活性肽；米曲霉L-天冬酰胺酶通过将关键丙烯酰胺前体L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸，有助于减少油炸食品中丙烯酰胺的形成；黑曲霉的酯酶和脂肪酶有助于改善风味、增强面团质构和果汁加工，而葡萄糖氧化酶用于纺织漂白和果汁保鲜中的脱氧。在生物质转化和生物燃料生产中，β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和纤维素酶在木质纤维素生物质降解中发挥重要作用，甘蔗渣、稻草和玉米秸秆等农业残余物经真菌酶混合物处理分解为可发酵糖；其中黑曲霉木聚糖酶已被证明可提高半纤维素糖化效率。此外，曲霉属产生的植酸酶改善动物饲料中磷的生物可利用性，而果胶酶通过降解植物果胶广泛用于葡萄酒和果汁澄清。除水解酶外，曲霉属在增值化学品和药物生产中亦发挥重要作用：土曲霉产生的洛伐他汀和衣康酸在聚合物工业和制药中应用广泛；工程化米曲霉菌株已被开发用于生产青霉素前体。此外，角蛋白酶和蛋白酶正被研究用于生物医学清创和羽毛等富角蛋白材料的转化；构巢曲霉和米曲霉产生的漆酶和角质酶等特种酶因其在绿色合成化学和生物修复中的潜在应用而日益受到关注。尽管实验室规模取得实质性进展，工程化米曲霉在工业环境中的实施仍面临氧气传递受限、剪切力敏感性、菌丝球形成和发酵过程中粘度导致的混合限制等挑战，因此工业可放大性需从菌株工程早期阶段加以考虑；未来策略应结合流变学优化、形态工程和胁迫耐受性提升，以创建能够在工业连续和补料分批发酵条件下高产出的菌株，下一代菌株改造应不仅优先实现高酶生产力，还应兼顾长期耐久性和工业可放大性。
**经典与进化菌株改良方法**
经典菌株改良策略在分子遗传学成熟之前很久便构成曲霉生物技术的支柱，五十余年来一直是工业菌株开发的主要策略，并为当今许多商业产酶菌株奠定基础。利用紫外线（UV）照射、甲基磺酸乙酯（EMS）、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（NTG/MNNG）、X射线照射以及新兴的常压室温等离子体（ARTP）诱变的随机诱变，已被用于增强水解酶分泌、胁迫耐受性、有机酸生产和生长性能。米曲霉、黑曲霉和土曲霉的诱变工作产生了酸性蛋白酶、曲酸、纤维素酶和淀粉酶滴度提高的菌株，部分提高达数倍。尽管精确基因组编辑技术出现，经典诱变仍具吸引力，因其为非转基因、简单且能改良许多复杂性状；但由于其随机突变模式，需要大量筛选和后续菌株稳定化。目前诱变已与基因组工程整合，以快速鉴定和优化有用突变。总体而言，基于突变的菌株改良仍是工业生物技术的重要基础，并通过提供显著遗传多样性继续补充基因组编辑技术。
**紫外线照射**
紫外线照射是广泛用于创建改良曲霉突变体的经典菌株改良技术，主要引起嘧啶二聚体等DNA损伤，导致随机突变及随后的DNA修复。在米曲霉中，紫外诱变已广泛用于增强酶分泌和异源蛋白生产。例如，紫外诱变产生的米曲霉突变体β-半乳糖苷酶产量提高，突变体UV-15–20达114.08 U/mL，较亲本菌株提高49.22%；此外，该技术也被用于提高曲霉淀粉酶产量并创建超高产突变体，如AUT1-8谱系通过增强蛋白生产机制产生的重组人溶菌酶和凝乳酶分别比亲本菌株高2.6倍和3.2倍。由于其低成本、高效率和简便性，紫外诱变仍是曲霉菌株改良最常用的诱变方法之一；然而，由于其随机突变模式，需要大量筛选以鉴定和维持理想突变体。
**γ射线和X射线**
γ射线和X射线照射是经典诱变技术，已通过产生广泛遗传变异用于改良工业米曲霉菌株。与诱导嘧啶二聚体的紫外照射不同，γ射线和X射线具有更强穿透能力，并通过产生活性氧产生广泛DNA损伤；这种广泛的突变谱增加了获得改良表型突变体的机会。在米曲霉中，γ射线照射已广泛用于诱变育种，比较分析表明其诱导适合改良工业性状的遗传突变；γ射线照射已成功用于曲霉菌株改良以提高淀粉水解酶产量，在米曲霉中产生的超高产突变体经五代后仍保留约95%酶活，显示其产生遗传稳定突变体的有效性；同样，其产生的黑曲霉突变体葡萄糖氧化酶活性为20.55–27.50 U/mL，而亲本菌株为7.5 U/mL，展示了γ射线照射的潜力。尽管两种方法均依赖电离辐射，γ射线诱变在曲霉育种中的应用远比X射线照射广泛；然而，同步辐射软X射线照射已成功用于产生米曲霉突变体，增强曲酸生产并改变代谢特征。由于能产生广泛遗传多样性，γ射线和X射线诱变策略用于开发产酶和发酵性能提高的改良菌株。与紫外照射相比，γ射线和X射线穿透深度更大并诱导多样基因组突变，但需要专门设施且突变效率低于高线性能量传递（LET）离子束照射。尽管这些诱变方法已被ARTP等更现代高效的诱变技术所超越，其仍为工业菌株改良和功能遗传研究提供有用工具。
**离子束照射**
离子束照射因其高突变效率和独特突变谱，已成为米曲霉先进的物理诱变方法。与传统的紫外或γ射线诱变不同，高LET离子束沿其照射径迹提供密集能量，对DNA产生广泛损伤，包括染色体重排、移码突变和碱基替换。比较研究表明，碳离子束的致死突变效应显著高于γ射线，产生对工业诱变育种重要的广泛遗传多样性；其在保持较高突变体存活率的同时诱导大规模基因组突变的能力，使其适合改良复杂工业菌株。在米曲霉中，碳离子束照射有效诱导硒酸盐抗性突变体，并较γ射线照射产生广泛遗传突变，证明其产生优良突变体的效率；此外，重离子照射已被用于提高泡盛曲霉淀粉水解酶产量。然而，由于对专门设施的需求和高运营成本，其应用相较紫外照射和ARTP诱变受到限制。
**基于常压室温等离子体（ARTP）诱变技术的新兴诱变方法**
ARTP近来已成为一种有效的非转基因诱变方法，通过产生全基因组突变改善曲霉产酶和其他表型特征。其产生活性氧诱导氧化性DNA损伤，在DNA修复过程中导致染色体重排、缺失、插入和碱基替换。其在微生物育种中具有巨大潜力，能够创建具有特定特征和优越性能的突变菌株，提高滴度、产量和生产力以满足生物工业需求。与紫外照射和化学诱变相比，ARTP具有更高诱变效率、更短处理时间和更高突变体存活率，从而增加筛选优良突变体的机会。在曲霉属中，ARTP诱变已成功通过快速产生多样突变体文库增强酶分泌、有机酸生产、胁迫耐受性和代谢性能。例如，ARTP诱变使白曲霉（*A. candidus*）和聚多曲霉（*A. sydowii*）的L-天冬酰胺酶产量在遗传稳定突变体中提高约2.3倍；在米曲霉中，ARTP结合适应性实验室进化（ALE）也被用于增强酸性蛋白酶生产和发酵性能，展示其在工业菌株育种中的效率。此外，ARTP衍生突变体已被开发用于增强葡糖淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶和其他工业酶的生产，以及改善对氧化胁迫、酸性pH、高底物浓度和发酵相关环境胁迫的耐受性。ARTP还被探索用于激活丝状真菌中沉默的次生代谢途径和增强生物活性化合物生产。在工业曲霉育种中，ARTP特别具吸引力，因其与孢子和基于原生质体的工作流程兼容，并可与包括液滴微流控和基于荧光的分泌测定在内的高通量筛选平台高效整合；这些筛选平台的组合可显著加速鉴定用于工业酶和代谢物生产的超高产菌株。因此，ARTP已成为菌株改良最重要的下一代非转基因诱变技术之一，并补充经典和现代基因组工程策略。
**化学诱变**
化学诱变是另一种广泛使用的经典菌株改良方法。与物理诱变不同，化学诱变剂通过脱氨、烷基化和碱基修饰插入点突变，从而产生广泛遗传多样性。常用化学诱变剂中，EMS、NTG/MNNG、叠氮化钠和亚硝酸已被广泛用于菌株改良。EMS是最常用的烷化剂，诱导GC→AT转换，产生大量适合正向遗传筛选的稳定点突变；与物理诱变相比，化学诱变产生大量点突变，使其特别适用于通过代谢和调控途径中的细微突变改良产酶。在米曲霉中，化学诱变已成功用于增强包括植酸酶和生物活性次生代谢产物在内的工业重要酶的产量。例如，经EMS、叠氮化钠和亚硝酸处理的米曲霉UJIIB-29产生的突变体植酸酶活性比亲本菌株高1.9倍；同样，NTG诱变米曲霉RP-21产生的突变体葡萄糖酸产量提高2.4倍，并伴随葡萄糖脱氢酶和葡萄糖氧化酶活性改善。尽管有效，化学诱变仍是随机方法，需要广泛的表型筛选和随后的分子表征以筛选有益突变。
**适应性实验室进化**
适应性实验室进化（ALE）提供了另一种强大的经典策略。通过在持续选择压力（如高纤维素负荷、低pH、渗透胁迫或毒素暴露）下培养菌株，有益突变随世代积累。黑曲霉ALE产生纤维素酶分泌提高数倍的菌株，而米曲霉ALE产生菊粉酶活性显著升高的变体。尽管ALE与遗传工程相比缓慢且非靶向，但其可改善由复杂调控架构控制、难以理性优化的性状。因此，ALE可与随机诱变结合，以加速菌株改良过程中有益突变的产生和筛选。即使在诱变或工程之后，迭代选择和筛选轮次仍然重要，因为仍须鉴定改良的生产者；传统筛选方法包括在指示培养基（如用于淀粉酶的淀粉碘平板、用于蛋白酶的透明圈测定）上铺板，或结合酶测定的小规模发酵罐。一旦发现命中，即回交或进一步突变以累积改良。
**原生质体融合**
原生质体融合是一种基于重组的经典菌株改良方法，用于重组具有理想性状的基因组以获得优越生产菌株。种内、种间和属间原生质体融合技术均已分别报道用于改善色素、β-葡萄糖苷酶和L-天冬酰胺酶的生产。通过酶法去除细胞壁并诱导聚乙二醇（PEG）介导的融合，研究人员重组不同菌株或物种的基因组以创建杂合菌株。与其他诱变技术不同，原生质体融合可同时重组多个亲本菌株的有益性状而无需靶向遗传修饰。经典示范显示，里氏木霉（*T. reesei*）与黑曲霉融合产生的菌株柠檬酸产量约为亲本黑曲霉菌株的三倍；不同黑曲霉菌株融合产生了改良的纤维素酶或淀粉酶分泌菌株；属内原生质体融合被用于曲霉属纤维素酶生产，如黄曲霉与土曲霉、构巢曲霉与塔宾曲霉（*A. tamarii*）、米曲霉与管状曲霉（*A. tubingensis*）之间的原生质体融合，所得菌株活性高于其他菌株。然而，尽管其在产生优越杂合体方面有效，原生质体融合仍面临若干瓶颈，包括融合效率低、融合子遗传不稳定、难以选择理想重组体以及大规模工业应用可重复性有限。
**基因组重排**
基因组重排是一种基于重组的途径，用于改善工业重要微生物表型。基因组重排是每一代多个亲本间的重组，并进行数轮基因组融合。与常规原生质体融合不同，基因组重排采用多轮融合与筛选优良突变菌株，允许来自不同菌株的有益突变在单一基因型中积累。该技术的优势在于无需了解微生物遗传背景即可进行遗传育种，使其成为高效方法。该方法加速有益突变的积累，已应用于增强纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和有机酸生产。例如，对灰绿曲霉（*A. glaucus*）应用基因组重排获得纤维素酶产量提高的菌株；同样，结合诱变、递归原生质体融合和高通量筛选被用于提高黑曲霉转糖基化活性。然而，仅有有限研究考察基因组重排技术提高转糖基化活性，其在曲霉中的更广泛应用仍受若干挑战限制，包括高效原生质体制备与再生、遗传和表型稳定性的维持以及工业相关发酵条件下改良菌株的验证。总之，基于突变的菌株改良方法已产生当今许多使用的曲霉高产菌株；工业菌株快速生长、高分泌通量和胁迫耐受性的关键特征往往源于数十年的经典育种。当代菌株工程日益依赖随机多样化、高通量表型分选、基因组解卷积和靶向重建的迭代整合；这些方法奠定的基础现已由现代分子工具在其上构建。经典育种方法并未被取代，而是日益作为现代遗传工程的补充途径，产生可随后表征和优化的宝贵突变。
**现代遗传工程与合成生物学**
遗传工程和合成生物学的最新进展已将曲霉属从传统改良的工业真菌转变为高度可编程的微生物细胞工厂。当前最先进的工程策略整合基于CRISPR的基因组编辑、合成启动子系统、途径重建、调控网络重连、分泌工程、底盘开发和系统代谢工程，以增强工业发酵条件下的酶分泌、有机酸生物合成、异源蛋白表达和菌株稳健性。在这些技术中，CRISPR/Cas系统已成为曲霉属精确基因组工程的核心平台。高效CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a系统现已在米曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉和酱油曲霉等物种中实现靶向基因缺失、多重编辑、启动子替换、转录调控和无标记基因组修饰。通过CRISPR介导缺失主要葡糖淀粉酶基因和蛋白酶基因，构建并优化了用于异源蛋白表达的黑曲霉底盘菌株（AnN1、AnN2），将多个基因盒引入工程化底盘实现高效异源蛋白生产；AnN2在标准发酵中实现多种蛋白的更高滴度，远超典型野生型水平，证明CRISPR用于异源蛋白生产的有效性。同样，CRISPR介导的米曲霉工程已实现分泌途径的靶向优化、不良次生代谢产物生物合成簇的消除和工业酶生产力的提高。合成生物学进一步实现了曲霉属复杂生物合成途径的重建和优化，多基因途径组装、模块化克隆系统和基因组规模代谢重连现已常规用于酶、有机酸、药物和次生代谢产物的生产。土曲霉的工程努力通过中心碳代谢优化和途径平衡改善了洛伐他汀和衣康酸生物合成。先进的底盘工程策略还通过缺失黄曲霉毒素、环匹阿尼酸和其他次生代谢产物基因簇，产生了无霉菌毒素的工业米曲霉谱系，显著提高了食品和生物制药应用的生物安全性。曲霉属不仅是酶工厂，也是强大的次生代谢产物生产者，代谢重连已显著提高曲酸、青霉素和有机酸产量；值得注意的是，通过插入或过表达生物合成基因，米曲霉菌株已被改造为曲酸和青霉素生产者，如Marui等通过gpdA启动子强过表达pcbAB和pcbC使米曲霉青霉素产量提高100倍；同样，通过表达氧化还原酶和转运蛋白基因构建了产曲酸的米曲霉菌株。除精确基因组编辑外，工业表型的进一步改善日益依赖转录和调控网络工程，合成启动子文库、可调表达系统和转录因子操作现广泛用于优化代谢流和分泌能力；AmyR、XlnR和CreA等调控蛋白已被广泛改造以改善淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶和其他CAZymes的表达；使用gpdA、amyB和glaA等强组成型或诱导型启动子的启动子工程已大幅增强工业菌株中的异源蛋白表达和途径平衡。工程曲霉属的另一重要前沿涉及分泌途径和细胞器工程，对ER相关折叠系统、囊泡运输、伴侣蛋白共表达、蛋白酶基因缺失和胁迫响应途径的操作已显著改善胞外蛋白分泌和菌株稳定性；蛋白稳态网络和糖基化途径的工程对于治疗性蛋白生产和工业酶成熟也日益重要。Novonesis（原Novozymes）近期工作获得了一个清除霉菌毒素基因的米曲霉谱系：通过天然分离去除黄曲霉毒素和环匹阿尼酸基因簇的大染色体缺失变体，随后缺失3-硝基丙酸基因，创建了无法产生米曲霉三种已知霉菌毒素的菌株；还使青霉素基因簇失活以去除任何非预期的抗生素生产。该谱系菌株现生产多种重组蛋白，包括GRAS批准的牛β-乳球蛋白生产菌株，无安全性顾虑，是精确育种而非随机诱变的强有力范例，其中基因组分析指导了整个毒素途径的去除。系统生物学和多组学技术现处于最先进曲霉工程的核心。比较基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学和通量组学日益与机器学习和基因组规模代谢模型整合，以识别工程靶点和预测代谢瓶颈；这些方法可合理改善工业发酵环境中的碳利用、能量利用、分泌能力和胁迫耐受性，同时ALE结合基因组重测序和基于CRISPR的重建已成为鉴定与更高产量和环境适应相关的有益突变的强大工具。尽管取得这些重大进展，仍有若干挑战限制曲霉属工业工程的发展：丝状生长形态使遗传操作、克隆分离和大规模筛选复杂化；与其他单细胞微生物不同，曲霉属经历从孢子到高度分枝多核菌丝网络的复杂发育，随后产孢繁殖；这种丝状菌丝网络导致异质真菌细胞群体、可变生长形态以及在菌株工程和工业发酵中难以维持遗传同质性；形态依赖性流变学、氧传递限制、异核体形成和菌株不稳定性仍是工业规模发酵的主要障碍。其他挑战包括脱靶基因组编辑、曲霉属物种间效率差异、可用调控遗传元件有限以及多重基因组工程困难；此外，平衡高分泌能力与细胞适应性和代谢负担仍是真菌细胞工厂设计的关键挑战。总体而言，基于CRISPR的遗传工程、合成生物学、代谢工程和人工智能辅助设计的整合正迅速推动曲霉属成为可持续生物工业生产的可编程真菌底盘；这些高通量基因组工程的进展预计将进一步加速开发能够高效生产酶、有机酸、药物和高价值生物化学品的稳健菌株。
**高通量筛选策略**
高效菌株改良需要筛选大量变体。目前曲霉属的高通量筛选（HTS）平台大致可分为基于液滴的微流控、基于生物传感器的筛选、荧光激活细胞分选（FACS）、自动化机器人筛选和基于图像的表面分型分析，各具快速筛选优良菌株的优势。近年来，HTS技术已适应于曲霉属。一项突破是使用基于液滴的微流控，将单个真菌孢子或小菌丝片段与生长培养基和荧光报告分子一起包封在纳升液滴中，并根据光密度或分泌酶活性进行分选；因此，HTS通过快速评估经典诱变、基于CRISPR的基因组编辑和适应性实验室进化产生的大型突变体文库，已成为现代菌株工程的关键部分。Beneyton等率先对黑曲霉进行基于液滴的微流控筛选，证明皮升尺度液滴不适用，因菌丝尖端迅速逸出隔室导致液滴聚并，而增大的纳升液滴成功支持菌丝生长，将分泌的α-淀粉酶保留在液滴内。该平台随后被用于米曲霉，筛选约450,000个液滴并鉴定出α-淀粉酶分泌高6.6倍的突变体，随后进行基因组重测序和与形态、蛋白分泌及碳水化合物代谢相关的有益突变的靶向验证，证明微流控HTS可大幅加速发现稀有高产菌株。微流控区室化、荧光酶测定和介电泳荧光激活液滴分选（DEP-FADS）的组合代表了从平板限制筛选向超高通量进化工程的转变：DEP-FADS根据荧光强度快速分选液滴，从而以单孢子分辨率直接筛选超高产突变体；该平台保持高速分选，以每秒四个液滴的准确度实现100%阳性液滴分选，并可在高达每秒21个液滴下稳定运行。此外，与常规微孔板筛选方法相比，基于液滴的微流控筛选方法大幅降低筛选时间和成本。一项研究量化表明，超高通量液滴微流控可在10 h内处理10
8个单独酶反应，使用少于150 μL的总反应体积，与常规机器人微孔板筛选相比实现1000倍筛选速度提升和约一百万倍成本降低。这些能力通过能够高效筛选经典诱变、基于CRISPR的工程和适应性实验室进化产生的大型突变体文库，从根本上改变了曲霉菌株改良；微流控不再是筛选数百个样品，而是允许在现实时间范围内筛选数十万个样品，如CRISPR文库、紫外/化学突变体文库或适应性进化群体。总之，基于液滴的微流控筛选代表了目前真菌生物技术可用的最强大HTS技术之一，提供速度、精度、微型化以及将表型分选与下游深度测序和靶向编辑耦合的能力。同时，荧光或比色生物传感器用于将酶活性与可检测信号联系起来。例如，荧光团或生色团偶联的底物被包含在琼脂或液体培养基中，分泌高水平酶的菌落产生明亮光晕；一些研究组工程化转录生物传感器，如目标代谢物诱导启动子的报告基因融合，这些在细菌中更为常见，但类似系统正在真菌中出现；对于曲霉，pH敏感染料或荧光聚糖可作为读出。常规生色和荧光底物仍是酶筛选最广泛使用的生物传感器，而基因编码生物传感器在真菌中仍在开发中。新兴生物传感器技术，如胞外分裂GFP，是目前正在探索以进一步提高真菌菌株筛选通量的概念。使用96或384孔板的自动化微孔板培养结合机器人操作和酶标仪被广泛用于曲霉属菌株的中等通量筛选，菌落挑选机器人可阵列化数千个菌落；自动显微镜检查和AI辅助成像的最新进展进一步实现了对真菌菌落形态、菌丝球形成和生长动力学的定量评估，为菌株选择提供额外表型信息。在细胞分选技术中，FACS为真菌菌株筛选提供了另一有价值平台。流式细胞术本身因大型菌丝而用于真菌受到限制，但可分选萌发中的孢子；近期方法将孢子FACS与诱导型表达结合，选择随后在培养中显示高产的克隆。随着突变基因敲除、启动子变体和转录因子过表达子的合成文库变得更大，HTS对于快速鉴定最佳候选者变得至关重要。然而，丝状生长带来独特挑战，如菌丝延伸超出液滴边界；包封策略、粘度调节、孢子限制和渗透平衡稳定的最新进展已使皮升液滴中微菌落的稳定形成成为可能。
**结论与未来展望**
曲霉菌株工程的发展历程反映了工业生物技术本身的演变。经典菌株改良方法创造了高产菌株，而现代菌株工程实现了精确基因组工程和高通量筛选。至关重要的是，这些方法是协同的。现代遗传工程、系统生物学和合成生物学并未取代经典菌株工程方法，而是对其进行补充，从而能够精确鉴定、验证和优化有用突变。最有效的结果来自用于突变体产生的迭代随机诱变、随后的用于突变鉴定的基因组测序、基于CRISPR的修饰以及用于鉴定高性能菌株的高通量筛选。随着技术进步，将可实现更复杂的方法。未来菌株改良将依赖通过高通量方法进行大规模组合遗传学，有效结合理性设计与定向进化。展望未来，合成和系统生物学将推动下一波创新。调控和代谢模型将有助于指导理性编辑；整合基因组规模建模、多组学和机器学习可预测如何平衡细胞生长与蛋白分泌。开发仅含必需基因的合成最小基因组的工业底盘菌株代表有前景的长期方向，允许针对特定蛋白生产优化的专用平台。包括先导编辑和碱基编辑在内的现代CRISPR工具可能允许在不引入双链断裂的情况下进行基因组工程，以尽量减少细胞胁迫；合成遗传回路还可能动态调整代谢途径以优化产量。尽管取得这些进展，未来挑战依然存在。曲霉的丝状特性、其菌丝生长模式以及异核体的存在使获得工程化克隆菌株的过程复杂化；分泌蛋白可能降解或错误折叠，使伴侣系统和蛋白稳态途径的操作成为持续的研究前沿；对于治疗性蛋白生产，糖基化模式往往需要人源化，需要深入的途径工程；此外，确保菌株在大规模发酵中的稳定性仍是关键问题。应对这些挑战需要真菌遗传学、系统生物学、工艺工程和计算设计的综合进展。总之，曲霉菌株工程正过渡到一个更先进的阶段，经典方法与尖端生物工具在此融合；下一代菌株很可能源于迭代进化方法与设计的合成构建体的整合。通过将基因组工程方法与下一代高通量筛选平台整合，将能够快速导航广阔的遗传设计空间并加速菌株工程。随着基因组工程、合成生物学、系统生物学、人工智能和高通量筛选的持续整合使开发完全可编程的真菌细胞工厂成为可能，这些细胞工厂可媲美或超越自然界最高效的超高产菌株，预计曲霉将继续处于工业生物技术的前沿。
