铜过载诱导肠系膜血管周脂肪组织氧化应激并调节血管反应性

《BioMetals》：Copper overload induces oxidative stress in mesenteric PVAT and modulates vascular reactivity

　　

铜（Copper）是参与多种生理功能所必需的微量营养素，然而，铜水平升高与血管功能障碍相关。既往证据表明，铜过载可促进血管周脂肪组织（perivascular adipose tissue，PVAT）的炎症反应，而PVAT是血管功能的关键调节者。在此背景下，研究人员探究了慢性铜过载是否调节肠系膜PVAT的氧化还原谱及血管反应性。将8周龄雄性Wistar大鼠分为两组：对照组（生理盐水，腹腔注射）和铜组（25.72 μg/kg/day的Cu，腹腔注射，持续30天）。收集肠系膜PVAT用于分析活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生、一氧化氮（nitric oxide，NO）生物利用度、H?O?水平、总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）基因表达，以及SOD1、过氧化氢酶（catalase）和NOX4蛋白表达。同时评估了血管对苯肾上腺素（phenylephrine）的反应性。血清样本用于生化分析。慢性铜过载增加了肠系膜PVAT中与ROS产生相关的荧光信号，并伴随SOD1蛋白表达降低和NOX4蛋白表达升高。总SOD活性、eNOS基因表达及过氧化氢酶蛋白水平均未观察到显著差异。NO生物利用度和H?O?水平亦保持无变化。在肠系膜动脉环中，铜处理在无PVAT条件下降低了血管对苯肾上腺素的反应性，而铜暴露后PVAT的抗收缩效应得以维持。在接受铜处理的Wistar大鼠肠系膜PVAT中观察到氧化还原相关参数的改变，同时在无PVAT条件下肠系膜动脉中苯肾上腺素诱导的收缩反应降低。然而，这种血管收缩反应减弱在有PVAT存在时未被观察到。

论文解读：慢性铜过载诱导肠系膜血管周脂肪组织氧化应激并调节血管反应性

一、研究背景与研究目的

铜（Copper）是参与细胞呼吸、氧化还原稳态及肽类激素合成等多种生理过程所必需的微量营养素。然而，铜暴露增加可能通过环境污染、膳食来源或过量补充而发生，其潜在毒性效应日益受到关注。由于铜具有氧化还原活性，铜过载有利于活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，并可能损害抗氧化系统，从而促成氧化还原失衡和心血管功能障碍。血管周脂肪组织（perivascular adipose tissue，PVAT）被公认为通过释放血管活性介质调节血管张力、进而调控血管收缩性的重要组织。肠系膜PVAT具有内脏白色脂肪组织特征，在炎症和氧化应激条件下，其形态和功能发生改变，抗收缩特性受损，进而促进血管功能障碍。既往研究已表明，铜暴露可降低胸主动脉血管反应性并升高糖尿病大鼠胸主动脉PVAT中促炎细胞因子水平；铜暴露还可降低乳头肌收缩力并升高血压，这些效应与氧化应激增加相关。最近研究进一步证实，以25.72 μg/kg/day剂量给予铜可经TLR4激活诱导肠系膜PVAT炎症，并伴随肾素-血管紧张素系统相关通路改变。基于此，研究人员假设慢性铜过载诱导肠系膜PVAT氧化还原改变，并与血管反应性变化相关。为验证该假设，研究人员检测了暴露于推荐每日铜剂量两倍的大鼠肠系膜动脉中ROS产生、抗氧化标志物、一氧化氮（nitric oxide，NO）生物利用度及血管反应性。

二、主要技术方法

研究人员选用8周龄雄性Wistar大鼠，随机分为对照组（腹腔注射生理盐水）和铜组（腹腔注射CuCl?，25.72 μg/kg/day，持续30天），该剂量为依据美国医学研究所和世界卫生组织推荐每日铜摄入量（12.85 μg/kg/day）的两倍。主要技术方法包括：采用二氢乙锭（dihydroethidium，DHE）荧光染色原位检测ROS产生，采用4,5-二氨基荧光素二乙酸酯（DAF-2DA）荧光染色评估NO产生；通过实时定量PCR检测内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）基因表达；采用Western blot检测SOD1、过氧化氢酶（catalase）和NOX4蛋白表达；基于肾上腺素自氧化抑制法测定总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用Amplex UltraRed试剂定量H?O?水平；利用wire myograph记录肠系膜动脉环（含或不含PVAT）对苯肾上腺素（phenylephrine，Phe）的浓度-反应曲线。血清样本用于血糖、甘油三酯和总胆固醇生化分析。

三、研究结果

3.1 慢性铜过载未改变体重或生化参数

以25.72 μg/kg/day剂量处理Wistar大鼠30天后，铜过载未改变体重增加、食物摄入或饲料效率。血糖、总胆固醇和甘油三酯水平亦无显著差异。

3.2 慢性铜过载增加肠系膜动脉PVAT中原位ROS产生及NOX4表达

铜过载处理30天显著增加了肠系膜PVAT中与ROS产生相关的DHE荧光信号（Cu: 4.55 ± 0.55 vs Ct: 1.24 ± 0.06，p = 0.0004）。与之一致，铜组NOX4蛋白表达显著升高（Cu: 3.23 ± 0.70 vs Ct: 1.00 ± 0.15，p = 0.0111）。H?O?产生在两组间无显著差异。

3.3 铜过载未改变肠系膜动脉PVAT中NO生物利用度

NO生物利用度荧光强度在对照组和铜组间无显著差异（Ct: 2.27 ± 0.19 vs Cu: 2.55 ± 0.19）。eNOS mRNA水平亦保持不变（Ct: 0.94 ± 0.08 vs Cu: 0.91 ± 0.04）。

3.4 慢性铜过载降低SOD1蛋白表达但不改变SOD活性或过氧化氢酶蛋白表达

铜过载动物SOD1蛋白表达显著降低（Cu: 0.61 ± 0.04 vs Ct: 1.0 ± 0.11，p = 0.009）。然而，SOD活性无显著差异（Ct: 0.15 ± 0.04 vs Cu: 0.12 ± 0.02）。过氧化氢酶蛋白水平亦保持不变（Ct: 1.0 ± 0.04 vs Cu: 1.2 ± 0.11）。

3.5 铜过载调节PVAT在肠系膜阻力动脉中的作用

在对照组和铜处理组中，PVAT的存在均降低了苯肾上腺素诱导的收缩反应，证实了PVAT的抗收缩效应。铜处理在无PVAT的血管环中降低了苯肾上腺素诱导的收缩反应，而在含完整PVAT的血管段中未观察到该降低效应。这表明铜处理在无PVAT条件下降低了血管对苯肾上腺素的反应性，而铜暴露后PVAT的抗收缩效应得以维持。

四、讨论与结论

研究发现，尽管生化参数无变化，接受25.7 μg/kg/day铜的动物肠系膜PVAT中DHE荧光信号增加，伴随SOD1蛋白水平降低，NOX4蛋白表达呈升高趋势，而H?O?和NO产生及过氧化氢酶蛋白表达在组间保持不变。铜的价态转换能力促进电子转移，未螯合的铜可增强ROS产生，特别是超氧阴离子（O?•?）和羟基自由基（•OH）。PVAT中ROS主要来源包括线粒体、NADPH氧化酶和解偶联的eNOS，过量ROS积累可能损害该组织的抗收缩效应。NOX4是脂肪细胞中主要表达的NADPH氧化酶亚型，主要产生H?O?。尽管NOX4表达升高，H?O?水平未检测到显著变化，可能因为高氧化环境下Cu2?被还原为Cu?，催化H?O?经Fenton反应和Haber-Weiss反应转化为•OH，导致H?O?被快速消耗。SOD1蛋白表达降低但总SOD活性未变，提示其他SOD亚型或调控机制可能维持了总SOD活性。NO水平与eNOS基因表达谱一致，提示NO对铜过载诱导的血管改变贡献有限。

在无PVAT条件下，铜对血管收缩反应的抑制作用可能与血管壁内在机制有关，包括内皮NO、氧化应激信号及血管平滑肌α-肾上腺素能反应性。铜暴露可能通过独立于PVAT的机制改变血管收缩反应。在有PVAT存在时，铜处理未导致血管低反应性，表明铜暴露后PVAT的抗收缩效应得以维持。研究提示，肠系膜PVAT氧化还原状态改变，连同既往已证实的TLR4、AT1R及血管紧张素II信号通路激活，可能与PVAT存在时观察到的血管反应改变相关。然而，本研究未建立氧化应激与血管表型之间的因果关系，血压和体内血管评估亦未进行。

结论：在接受25.72 μg/kg/day铜剂量30天的年轻Wistar大鼠肠系膜PVAT中观察到氧化还原相关参数的改变，同时在无PVAT条件下肠系膜动脉中苯肾上腺素诱导的收缩反应降低。然而，该血管收缩反应减弱在有PVAT存在时未被观察到，提示该组织在铜诱导的血管改变中可能发挥调节作用。