《Cell and Tissue Banking》：Effects of glycerol processing on the biomechanical, structural, optical, and antimicrobial properties of human amniotic membrane
编辑推荐：
人羊膜（hAM）在烧伤护理中用作生物敷料，保存方法可能影响其结构和功能特征。本研究评估基于甘油的加工与保存方法对hAM特性的影响。胎盘取自一家三级学术医院择期剖宫产后的142名知情同意供者。hAM经抗生素-抗真菌去污染后，使用≥99.5%甘油并辅以振荡循环和中
人羊膜（hAM）在烧伤护理中用作生物敷料，保存方法可能影响其结构和功能特征。本研究评估基于甘油的加工与保存方法对hAM特性的影响。胎盘取自一家三级学术医院择期剖宫产后的142名知情同意供者。hAM经抗生素-抗真菌去污染后，使用≥99.5%甘油并辅以振荡循环和中间生理盐水冲洗进行加工。对来自71名供者的配对加工与未加工样本评估生物力学特性、光学透过率、厚度、细菌抑制和组织学特征。统计分析包括配对t检验、重复测量方差分析（ANOVA）和效应量（Cohen’s d）。加工导致极限抗拉强度（?7.6%）和拉伸应力（?6.1%）轻度降低，效应量小，而拉伸应变未显著改变。光学透过率从90.8%增至97.1%（p < 0.001；Cohen’s d ?0.92），厚度降低2.9%。冷藏保存12个月后，在相同条件下，甘油加工hAM对全部五种受试细菌种类产生的抑菌圈均大于未加工hAM。定性组织学评估显示上皮丢失、基质细胞减少和基质形态改变，而基底膜仍可见连续。加工hAM表现出可测的生物力学性能和细菌抑制，同时光学透过率增加，并伴有加工相关组织学改变。这些体外发现描述了基于甘油的加工与保存方法的效果，但未确立临床疗效。需要进一步体内评价，以确定这些实验室发现是否转化为安全有效的临床性能。
研究背景与问题：烧伤创面管理的目标在于恢复长期外形、功能和生活质量，皮肤替代物可提供临时或永久覆盖并支持创面闭合。与合成皮肤替代物相比，生物皮肤替代物保留更完整的天然细胞外基质结构，可能支持更自然的真皮形成和再上皮化。常见生物替代物包括尸体皮肤同种异体移植物、牛胶原敷料、猪异种移植物和人羊膜（hAM，human amniotic membrane，胎盘来源生物敷料）。但尸体皮肤同种异体移植物依赖遗体捐献和皮肤库基础设施，在低收入和中等收入国家（LMICs）等资源有限环境中可及性受限；异种移植物存在不整合、排斥和感染风险等限制。hAM具有低免疫原性、天然抗菌活性、可紧密贴合创面，并可来源于分娩后本应丢弃的胎盘组织，因而可能是临时创面覆盖的可及生物材料。hAM的临床使用取决于加工与保存方法能否在提供储存稳定性和微生物安全性的同时维持相关结构和功能特征。已有保存策略包括冷冻保存、冻干、脱水和甘油保存；甘油保存方案在甘油浓度、温度、暴露时间、去污染程序和辅助保存方法上缺乏标准化，报告结果在机械完整性、结构保存、光学性能和抗菌活性方面存在差异。过氧乙酸-乙醇灭菌（PES/GLYC）虽可广谱灭菌，但其强氧化化学可能改变膜结构和生物力学特性。基于此，研究人员开发了避免氧化灭菌剂、脱水和低温储存的甘油加工与保存方法，并假设该方法可限制加工相关改变，同时保留膜的关键特征；研究评估该方法对hAM生物力学、结构、光学和抗菌特性的影响，光学透过率作为可能反映加工相关膜组成和结构变化的物理化学特征，而非烧伤创面覆盖临床性能的主要指标。
研究人员开展的研究、结论与意义：这是一项前瞻性、实验室体外实验，采用同一供者配对设计比较甘油加工hAM与未加工hAM，以减少供者间变异，评估拉伸强度、拉伸应变、光学透过率、厚度、抗菌活性和组织学特征。研究结果显示，加工后hAM仍具有可测的生物力学性能和细菌抑制能力，光学透过率增加，并出现加工相关组织学改变；极限抗拉强度和厚度轻度降低，最大拉伸应变未显著改变。研究意义在于描述该甘油加工与保存方法在体外条件下对hAM选定特性的影响，为后续体内评价提供实验室依据；但体外结果不能确立临床疗效，也不能确定其烧伤创面应用中的安全性、生物相容性或宿主反应。
关键技术方法（≤250字）：研究为前瞻性、实验室体外实验。胎盘来自南非Gauteng省一家三级学术医院产科，纳入年龄≥18岁、孕周≥36周并接受择期剖宫产的知情同意供者；排除胎膜早破、显著生殖道感染、羊膜感染综合征、胎儿或新生儿已知先天畸形、毒血症、胎粪污染羊水及HIV/HBV/HCV/梅毒血清阳性者。最终142名合格供者；随机选取71对加工与未加工样本用于配对生物力学和光学测试，厚度评估使用全部142例；1–4 °C保存12个月后，对五种烧伤创面病原进行纸片扩散法抑菌圈测量；组织学采用H&E（hematoxylin and eosin，苏木精-伊红）、Masson’s trichrome（马松三色）和PAS（periodic acid–Schiff，过碘酸-雪夫）染色光镜定性评价；统计采用配对t检验、重复测量ANOVA和Cohen’s d。
研究结果：
（1）生物力学性能测试（Biomechanical properties test）：通过同一供者配对样本的单轴拉伸测试比较，甘油加工导致拉伸强度、拉伸应力和厚度轻度降低，光学透过率增加，而最大拉伸应变未显著改变。
（2）极限抗拉强度（Ultimate tensile strength，UTS）：配对比较显示平均UTS由未加工hAM的6.6 ± 1.1 MPa降至加工后的6.1 ± 1.2 MPa，降低7.6%（p < 0.001；Cohen’s d = 0.24），差异有统计学意义但幅度和效应量小。
（3）拉伸应力（Tensile stress）：平均最大载荷下拉伸应力由6.51 ± 1.1 MPa降至6.11 ± 1.00 MPa，降低6.1%（p < 0.001；Cohen’s d = 0.20）。
（4）最大拉伸应变（Maximum tensile strain，MTS）：平均MTS由8.2 ± 1.3%降至7.9 ± 1.9%，降低3.7%，差异无统计学意义（p = 0.262；Cohen’s d = 0.15）。
（5）光学透过率（Optical transmittance）：配对测量显示平均光学透过率由90.82 ± 4.39%增至97.07 ± 5.81%，绝对增加6.25个百分点、相对增加6.9%（p < 0.001；Cohen’s d = 0.92）。
（6）厚度（Thickness）：平均膜厚度由0.035 ± 0.002 mm降至0.034 ± 0.002 mm（p = 0.001；Cohen’s d = 0.50）。
（7）抗菌活性测定（Antimicrobial activity assay）：12个月冷藏保存后，在相同病原体特异性培养基条件下，未加工hAM对五种细菌均仅产生小抑菌圈，而甘油加工hAM产生明显更大的抑菌圈。加工hAM对Streptococcus pyogenes（S. pyogenes）抑菌圈最大（12.42 ± 0.48 mm），其次为Escherichia coli（E. coli，8.37 ± 0.43 mm）和Staphylococcus aureus（S. aureus，7.74 ± 0.39 mm），Klebsiella pneumoniae（K. pneumoniae，6.44 ± 0.46 mm）和Pseudomonas aeruginosa（P. aeruginosa，6.03 ± 0.39 mm）较小；菌种间差异显著（重复测量ANOVA，p < 0.0001；Tukey事后检验p < 0.001）。未加工hAM平均抑菌圈为E. coli 0.61 ± 0.24 mm、S. aureus 0.54 ± 0.23 mm、S. pyogenes 0.41 ± 0.30 mm、K. pneumoniae 0.41 ± 0.30 mm、P. aeruginosa 0.40 ± 0.27 mm；菌种间差异显著（F(4,280) = 12.05，p < 0.0001），E. coli抑菌圈大于S. pyogenes、K. pneumoniae和P. aeruginosa（p ≤ 0.0001），S. aureus也大于上述三种（p = 0.026、0.020、0.011），E. coli与S. aureus无显著差异（p = 0.563），S. pyogenes、K. pneumoniae和P. aeruginosa之间无显著差异（p ≥ 0.999）。hAM圆片下未检测到细菌生长。营养琼脂条件下抑菌圈一般较大，S. pyogenes在两种培养基条件下均最大，E. coli在两种培养基间相似，P. aeruginosa、K. pneumoniae和S. aureus在培养基间差异较大。作者指出残余甘油未定量，不能将较大抑制完全归因于hAM内在抗菌特性。
（8）组织学评价（Histological evaluation）：通过H&E、PAS和Masson’s trichrome染色光镜定性比较，未加工样本H&E显示完整上皮层和保留的细胞形态，加工后显示上皮完全丢失和细胞减少；PAS显示未加工和加工样本基底膜均连续；Masson’s trichrome显示未加工样本胶原结构清晰，加工后胶原定义减少和基质改变。
讨论部分总结：讨论指出，甘油加工导致拉伸强度和拉伸应力小幅但统计学显著降低，效应量小，最大拉伸应变未显著改变；本研究的UTS降低7.6%，低于von Versen-Hoeynck et al.报告的PES/GLYC相较风干膜约46%的降低，而Tanaka et al.显示化学交联可显著改变hAM拉伸性能。因此，该甘油方案在所用实验条件下对测得拉伸性能改变相对有限，但体外拉伸测试不能确定这些变化对膜操作、创面贴合和烧伤创面应用中机械性能的临床意义。光学透过率增加表明加工hAM在测量条件下允许更高比例入射光通过；这对眼科应用重要，但不是烧伤创面覆盖的主要功能要求，可能作为便于不去除敷料观察创面床的次要实用优势。甘油诱导的组织光学清除被归因于组织脱水、折射率匹配和光散射减少等机制；本研究透过率增加应结合组织学显示上皮和基质细胞耗竭而基底膜连续来解释，可能反映组织组成改变而非膜完整性本身改善。厚度降低0.001 mm虽统计学显著，但绝对值很小，仍在羊膜通常报告的0.02–0.05 mm临床可接受范围内。抗菌方面，加工hAM在12个月冷藏后对五种细菌均有可测抑制，抑菌圈随菌种和培养基变化；未加工hAM在相同条件下抑菌圈小。既往体外研究也报告hAM对S. aureus、E. coli和P. aeruginosa等革兰阳性和革兰阴性菌的抗菌作用；除抑菌圈外，hAM圆片下无细菌生长，Talmi et al.也观察到类似膜下抑制，提示直接膜接触或屏障效应可能参与。但加工hAM抑菌圈更大需谨慎解释：两组均保存12个月、1–4 °C，未加工hAM保存在无菌生理盐水，加工hAM保存在甘油；尽管测试前充分冲洗，残余甘油未定量，不能排除残余甘油贡献，该比较仅说明实验条件下存在加工相关差异，不能确定机制；琼脂试验不能复现烧伤创面复杂微生物和宿主环境，抑菌圈也不能完全代表接触或屏障效应，因此应视为实验条件下的细菌抑制证据而非临床抗菌疗效证据。培养基影响抑菌圈测量，营养琼脂实验仅用加工hAM，不能建立机制或抑制来源。组织学显示加工相关形态改变，包括羊膜上皮层丢失、基质细胞减少和基质外观改变，但PAS显示基底膜仍可见连续；Masson’s trichrome显示加工样本胶原染色定义减少，提示基质改变而非天然组织结构的完全保存。既往保存hAM组织学评价也报告上皮和基质细胞改变；基底膜可见连续可能相关，因为羊膜基底膜含参与上皮细胞黏附和分化的细胞外基质成分，但本研究仅显示形态保留，未确立这些基质成分生物活性或功能特性的保存。组织学为定性评估，未定量分析细胞密度、基底膜厚度和胶原染色，应视为加工相关形态改变的描述性证据。局限性包括：研究完全为体外，不能确立临床疗效或预测创面愈合、生物相容性和宿主反应；正在开展部分厚度烧伤患者临床研究以评价体内性能和临床疗效；拉伸测试参考ASTM D882-12，但缺乏hAM专用标准化方案，过夜风干减少夹持滑移但脱水可改变软组织生物力学行为，测得值应解释为标准化测试条件下的比较性机械性能而非天然水合状态绝对性能；仅评估1–4 °C甘油保存12个月，不能外推至更长保存期；抗菌方面残余甘油未定量，未加工hAM未在营养琼脂测试；组织学为定性；未与其他既定hAM保存方法直接比较，配对设计减少供者间变异但不能确立该方案相对冷冻保存、冻干或其他甘油保存方法的性能。
研究结论（翻译）：在1–4 °C甘油保存12个月后，加工hAM表现出可测的生物力学性能和细菌抑制、光学透过率增加以及加工相关组织学改变。观察到拉伸强度和厚度轻度降低，而最大拉伸应变未显著改变。定性组织学评估显示细胞减少和基质改变，而基底膜仍可见连续。总体而言，这些发现描述了基于甘油的加工与保存方法在体外条件下对hAM选定特性的影响。然而，这些发现的临床意义及其对烧伤创面性能的影响不能由本研究确立。需要进一步体内评价，以确定这些实验室发现是否转化为安全有效的临床性能。
