《Frontiers in Immunology》：Tissue factor-associated neutrophil extracellular traps in dermatomyositis: procoagulant activity and endothelial activation in vitro
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引言： 皮肌炎（dermatomyositis, DM）是一种免疫介导的肌病，以炎症和血管表现为特征，并伴有不同程度的全身受累；然而，中性粒细胞活化、补体与凝血之间的相互作用仍不清楚。研究人员探讨了DM患者血清能否诱导组织因子（tissue f
摘要专业翻译：
引言： 皮肌炎（dermatomyositis, DM）是一种免疫介导的肌病，以炎症和血管表现为特征，并伴有不同程度的全身受累；然而，中性粒细胞活化、补体与凝血之间的相互作用仍不清楚。研究人员探讨了DM患者血清能否诱导组织因子（tissue factor, TF）相关的中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs）形成，并检测了其体外（in vitro）功能效应。
方法： 研究人员对7例活动性DM患者和7例年龄/性别匹配的健康个体的血清进行了炎症介质、瓜氨酸化组蛋白H3（citrullinated histone H3, CitH3）、凝血酶-抗凝血酶（thrombin–antithrombin, TAT）复合物、可溶性C5b-9（soluble C5b-9）及脱氧核糖核酸酶-I（DNase-I）活性分析。将对照中性粒细胞暴露于DM血清，随后评估NET形成、TF表达与活性以及凝血酶生成。针对补体、TF和NETs进行了抑制实验。共培养实验评估了内皮细胞活化，并对皮肤活检标本进行了免疫荧光检测。
结果： DM患者表现出炎症介质、CitH3、TAT复合物和可溶性C5b-9水平升高，同时DNase-I活性降低。DM血清诱导对照中性粒细胞表达TF并释放TF相关NETs。DNase-I和依库珠单抗（eculizumab）减少了NET形成，而依库珠单抗还降低了TF mRNA表达和NET相关TF活性。TF相关NETs促进了人主动脉内皮细胞黏附分子的表达，该效应可被DNase-I或TF中和所减弱。在DM皮损皮肤中检测到TF阳性NET片段，而健康皮肤中未检测到。
讨论： 这些探索性发现支持C5依赖性补体激活对TF相关NET形成的贡献，并表明这些NETs可在体外增强凝血酶生成和内皮细胞活化。其与临床血管病变或血栓风险的关系尚不清楚，为DM中炎症、血栓形成与血管损伤之间的潜在联系提供了证据。
论文主体内容解读：
一、研究背景与问题
皮肌炎（dermatomyositis, DM）是一种异质性免疫介导性疾病，以皮肤炎症为特征，可伴或不伴肌肉受累，并存在多种全身表现，包括间质性肺病（interstitial lung disease, ILD）。血管异常是DM病理谱的重要组成部分，肌肉中可见毛细血管丢失和束周改变，皮肤中可出现内皮改变、甲周异常、红斑，严重者甚至发生皮肤溃疡。然而，将炎症与DM中内皮及凝血相关反应联系起来的机制尚未完全阐明。
I型干扰素信号传导和补体激活是DM病理生物学中两个公认的组成部分。I型干扰素刺激基因特征在受累组织和外周血中均可检测到，可能促进持续性炎症和血管改变。补体在微血管中的沉积与内皮损伤和毛细血管丢失相关。尽管这两条通路都可能影响血管炎症，但它们与DM中中性粒细胞活化和凝血的关系尚未明确建立。
中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs）是由中性粒细胞释放的细胞外染色质及相关蛋白组成，参与炎症和凝血过程。既往DM研究报道血液和受累组织中NET形成增加，同时NET降解受损。然而，这些NET的组成和功能活性尚未被详细研究，特别是DM炎症环境中生成的NETs是否影响凝血或内皮细胞尚不清楚。
组织因子（tissue factor, TF）启动外源性凝血途径，可由活化的中性粒细胞表达或由NETs携带。TF相关NETs已在其他炎症性疾病中被描述，可支持凝血酶生成并促进内皮细胞活化。DM血清是否能诱导TF相关NETs形成、哪些血清成分参与该反应、以及产生的NETs能否影响内皮细胞，这些问题均缺乏充分表征。
二、研究目的与意义
这项探索性研究旨在探讨DM患者血清能否诱导具有促凝血活性的TF相关NETs形成，并评估细胞外DNA/NET相关物质、C5依赖性补体激活和血清相关TF的贡献，同时评估DM血清诱导的NETs对人内皮细胞的影响，并检查DM皮损皮肤中是否存在TF阳性NET物质。研究在离体（ex vivo）、体外（in vitro）和原位（in situ）条件下进行，未设计用于评估临床血栓形成、血栓风险或血栓性血管病变。
三、主要关键技术方法
研究人员纳入了7例活动性皮肤病变的DM患者和7例年龄/性别匹配的健康个体作为对照，并获取了所有DM患者的皮肤活检标本，以及3例健康个体的对照皮肤组织。主要技术方法包括：多重蛋白检测分析血清炎症介质；ELISA检测CitH3、TAT复合物、可溶性C5b-9及DNase-I活性；密度梯度离心法分离健康对照中性粒细胞；免疫荧光共聚焦显微镜检测NET形成及TF与中性粒细胞弹性蛋白酶的共定位；RT-qPCR检测TF mRNA表达；NET结构分离后进行TF活性和TAT生成检测；使用依库珠单抗（抗C5抗体）、DNase-I和抗TF中和抗体进行抑制实验；人主动脉内皮细胞（HAoECs）共培养实验检测黏附分子表达；皮肤活检组织免疫荧光染色分析。
四、研究结果
1. DM患者血清呈现失调的炎症谱
多重蛋白检测显示，DM患者血清中IL-6、IL-8、TNF-α和MCP-1水平显著高于健康个体。ELISA检测进一步显示DM患者循环中CitH3、TAT复合物和可溶性C5b-9水平升高，而DNase-I活性显著降低。这些发现表明DM中存在改变的循环炎症谱，伴有NET形成、凝血激活和终末补体激活标志物增加以及DNase-I活性降低。
2. DM患者血清促进对照中性粒细胞NET形成
将健康个体来源的中性粒细胞暴露于DM患者血清后，免疫荧光显微镜显示NET形成显著增加，ELISA检测的NET中CitH3水平也相应升高。这表明活动性DM患者血液中循环的可溶性因子能够促进健康中性粒细胞形成NET表型，为DM相关炎症环境可能促进中性粒细胞活化提供了功能证据。
3. DM血清诱导的NETs富含组织因子
RT-qPCR检测显示，DM血清诱导对照中性粒细胞TF表达增加。免疫荧光显微镜证实，暴露于DM血清的对照中性粒细胞高效生成覆盖TF的NETs。ELISA检测显示，分离的NETs中TAT复合物形成和TF活性均增加，表明NET相关TF具有功能活性。用DNase-I分解NET结构或中和NET上的TF可显著降低TAT水平和TF活性。这些发现表明DM血清在对照中性粒细胞中诱导了促凝血NET表型，NET相关TF参与了凝血酶生成。
4. 依库珠单抗减弱DM血清诱导的NET形成和TF诱导
将DM血清预先与依库珠单抗（抗C5抗体）、抗TF抗体或DNase-I孵育后再暴露于对照中性粒细胞。依库珠单抗显著减少NET形成，DNase-I降解预先存在的NETs也导致NETs显著减少，而TF中和未显著影响NET形成，表明血清相关TF在该实验条件下并非NET形成所必需。C5抑制显著降低TF mRNA表达和NET上的TF活性。探索性实验中，托法替布（tofacitinib）也降低了DM血清诱导的TF mRNA表达。DNase-I处理或血清相关TF中和均不影响中性粒细胞新生TF表达或后续NET上的TF活性。这些发现支持DM血清诱导的NET形成和TF诱导对C5阻断敏感，但未建立直接的通路激活或信号层级。
5. TF相关NETs在体外促进内皮细胞活化
将人主动脉内皮细胞（HAoECs）暴露于DM血清诱导的NETs（DM NETs）后，VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、E-选择素和P-选择素的表达均显著增加。DNase-I处理DM NETs可显著减弱该反应，支持完整NET支架的贡献。DM NETs上TF的中和也降低了内皮活化标志物的表达，支持NET相关TF的参与。这些发现表明DM血清诱导的NETs在体外促进内皮细胞活化，但未建立体内内皮损伤或功能障碍。
6. DM皮损皮肤中检测到TF阳性NET残片
在DM患者皮肤活检标本中，未观察到完整中性粒细胞，但在汗腺分泌 coil 中检测到中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase, NE）和CitH3双阳性结构，与NET残片一致。免疫荧光显示TF在这些NET片段内共表达，表明DM皮损皮肤中存在TF阳性NET片段。健康个体皮肤活检中未检测到NET残片或TF阳性NET片段。半定量分析显示DM皮损皮肤中TF阳性NET相关染色高于健康皮肤。
五、讨论与结论
讨论总结：
这项探索性研究显示，DM患者循环中炎症介质、CitH3、TAT复合物和可溶性C5b-9水平升高，同时DNase-I活性降低。DM血清诱导对照中性粒细胞NET形成和TF表达，产生的NETs携带功能活性的TF。分离的NET制剂显示TAT生成和TF活性增加，破坏NET支架或直接中和NET相关TF可减少这两种读数。DM血清诱导的NETs还在体外激活人内皮细胞，且DM皮损皮肤中检测到TF阳性NET片段。这些发现将血清介导的中性粒细胞活化与凝血和内皮细胞活化联系起来，但未确立临床血栓形成、血栓风险增加或血栓性血管病变。
DNase-I处理DM血清减少了后续NET形成，提示循环中已存在的细胞外DNA或NET相关物质可能促进进一步NET释放。依库珠单抗减少了NET形成、TF mRNA表达和NET相关TF活性，而中和DM血清中已存在的TF不影响NET形成或中性粒细胞新生TF表达，表明循环TF不是这些反应的主要驱动因素。这不同于对分离NETs上TF的直接中和，后者减少了其促凝血活性。
补体依赖性中性粒细胞TF诱导通过C5a–C5aR信号传导在抗磷脂抗体模型中已有描述，但该结果未建立补体激活、细胞外DNA和TF之间的直接信号序列，也未将补体确定为中性粒细胞活化的唯一血清因子。血清sC5b-9作为终末补体激活标志物被测量，而C5a未被测量。尽管依库珠单抗阻止C5进一步裂解，但观察到的效应不能特异性地归因于C5a，治疗后残余补体活性未被直接确认。
DM血清诱导的NETs增加了HAoECs中ICAM-1、VCAM-1、E-选择素、P-选择素和PECAM-1的表达，该反应被DNase-I和NET相关TF中和所减弱，支持完整NET支架和TF的共同贡献。这些实验证明了体外内皮细胞活化，但未建立体内内皮损伤、屏障功能障碍或微血管损伤。HAoECs提供了概念验证性内皮模型，但不能重现DM中涉及的皮肤微血管内皮的特定性质。
NET形成与血管损伤之间的关系方向仍未解决。TF相关NETs可能放大已建立的炎症性血管过程，而内皮损伤和持续性炎症本身可能促进中性粒细胞活化和NET释放。这些机制并不相互排斥，可能作为相互过程运作。确定TF相关NETs是启动还是放大微血管损伤，需要在DM相关体内模型中选择性破坏NET形成或中性粒细胞TF。
皮肤发现提供了进一步证据，表明TF相关NET物质存在于皮肤病变部位。血管病变和皮肤溃疡是DM的公认表现，使这些结构的定位可能具有相关性。然而，组织分析不能确定NET片段是在局部形成还是从循环中沉积，也未证明局部凝血酶生成、内皮损伤或微血管闭塞。
在探索性实验中，托法替布降低了DM血清诱导的TF mRNA表达，这与JAK抑制的药理学敏感性一致，但STAT磷酸化和JAK/STAT靶点参与的其他指标未被评估，不应被解释为JAK/STAT通路激活或JAK/STAT与补体信号之间机制性串扰的直接证据。
结论翻译：
总之，DM血清诱导了TF相关NETs的形成，分离的NET制剂在体外增加了TF活性和TAT生成。DM血清诱导的NETs还促进了内皮细胞活化，该反应可被DNase-I处理或TF中和所减弱。皮损皮肤中也发现了TF阳性NET片段。NET相关TF与疾病活动度、临床血管病变或血栓风险之间的潜在关系有待更大规模的前瞻性研究进一步调查。
