巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）通过维持线粒体生物能量学支持炎症性巨噬细胞活化

《Frontiers in Cell Death》：Macrophage migration inhibitory factor (MIF) supports mitochondrial metabolism during inflammatory macrophage activation

　　

中文摘要翻译 巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）是一种多效性促炎细胞因子，在巨噬细胞关键塑造免疫结局的炎症性疾病中发挥作用。尽管MIF已被联系到巨噬细胞极化，但其对生物能量学的贡献仍未被充分定义。在本研究中，研究人员探讨了MIF如何调节来自野生型（WT）和MIF基因敲除（Mif?/?）小鼠的骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）在线粒体功能中的作用，这些细胞处于非极化（M0）、重组MIF处理（M0 + rMIF）以及M1或M2极化条件下。与M1WT巨噬细胞相比，M1Mif?/?巨噬细胞表现出活性氧（ROS）、超氧化物（O2•?）和一氧化氮（NO）的产生减少，同时伴有线粒体膜电位（MMP）降低和氧化磷酸化（OXPHOS）受损。相比之下，M2Mif?/?巨噬细胞仅在精氨酸酶活性和线粒体参数方面表现出适度降低。总之，这些发现表明内源性MIF对于在炎症性M1活化过程中维持线粒体生物能量学能力至关重要，而M2分化则基本得以保留。这种表型依赖性调控凸显了MIF在塑造巨噬细胞活化途径以及在炎症反应中决定巨噬细胞命运方面的关键作用。

论文解读文章

研究背景与科学问题

巨噬细胞作为先天免疫系统的核心效应细胞，其功能高度依赖于代谢重编程。经典的M1型（促炎）巨噬细胞主要依赖糖酵解以满足快速产生细胞因子和抗菌活性所需的能量与生物合成需求，而替代激活的M2型（抗炎/修复）巨噬细胞则高度依赖线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）和三羧酸（TCA）循环。线粒体不仅是细胞的能量工厂，更是活性氧（ROS）信号、代谢物交换和炎症调控的关键枢纽。巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）是一种多效性促炎细胞因子，通过结合CD74/CD44等受体复合物激活ERK1/2、AMPK和AKT等下游信号通路，在多种炎症性疾病中发挥重要作用。已有研究表明MIF参与调节巨噬细胞极化，但MIF是否直接影响巨噬细胞的极化方向，还是通过支持线粒体代谢基础设施从而为特定活化程序提供能量支撑，这一问题尚不明确。特别是，MIF对M1和M2两种不同极化状态下线粒体生物能量学的差异性贡献，目前缺乏系统性的比较研究。因此，本研究旨在阐明MIF是否以表型依赖的方式影响巨噬细胞极化过程中的线粒体生物能量学能力，从而揭示其在炎症反应中的代谢支持机制。

研究设计与主要结论

为解答上述问题，研究人员从野生型（WT）和MIF基因敲除（Mif^?/?）的BALB/c小鼠中分离并培养骨髓源性巨噬细胞（BMDMs），在体外分别诱导为非极化（M0）、经典活化（M1，使用LPS+IFN-γ刺激）、替代活化（M2，使用IL-4+IL-13刺激）以及重组MIF（rMIF）处理的M0状态。通过系统性检测M1相关效应分子（总ROS、线粒体超氧化物O₂^•?、一氧化氮NO）、M2标志物（精氨酸酶活性）以及一系列线粒体功能指标（线粒体膜电位MMP、NAD(P)H脱氢酶活性、线粒体呼吸参数和ATP生成速率），全面评估MIF缺失对不同极化状态下巨噬细胞线粒体生物能量学的影响。

研究得出的核心结论是：内源性MIF对于维持炎症性M1巨噬细胞的线粒体生物能量学能力至关重要，其缺失会显著削弱M1相关的效应功能和线粒体呼吸功能；而M2巨噬细胞在缺乏MIF的情况下仍能保持关键的替代活化特征，显示出更强的代谢灵活性。这一发现将MIF的角色从单纯的极化诱导因子拓展为一种允许性的代谢支持因子，为理解MIF在炎症疾病中的作用提供了新的视角。

关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术手段开展本研究：

1. 1.
   流式细胞术：用于验证巨噬细胞极化状态，通过F4/80、MHC-II、CD86（M1标记）和CD206（M2标记）抗体组合进行分型鉴定。
2. 2.
   荧光探针检测：使用H₂DCFDA探针检测总ROS水平；使用MitoSOX? Red探针特异性检测线粒体超氧化物（O₂^•?）。
3. 3.
   生化比色法：采用Griess法测定培养上清液中亚硝酸盐浓度以反映NO产量；通过尿素生成量测定精氨酸酶活性。
4. 4.
   激光共聚焦显微镜与流式细胞术：利用MitoTracker Orange染色结合共聚焦显微镜观察线粒体膜电位（MMP），并使用JC-10染料通过流式细胞术定量分析MMP变化。
5. 5.
   海马生物能量分析（Seahorse XF96）：这是本研究的核心技术平台。通过线粒体压力测试（Mito Stress Test）测量基础呼吸、ATP偶联呼吸、质子漏、最大呼吸能力和备用呼吸容量等关键参数；并通过实时ATP速率测定（Real-Time ATP Rate Assay）区分并量化糖酵解来源ATP（GlycoATP）和线粒体OXPHOS来源ATP（MitoATP）。

研究结果详解

3.1 MIF缺失减弱M1巨噬细胞的ROS和NO合成，但不改变M2巨噬细胞的精氨酸酶活性

研究人员首先通过流式细胞术确认了WT和Mif^?/? BMDMs在不同刺激下均能有效极化为M1或M2表型，表明MIF并非巨噬细胞获得极化表型的必要条件。然而，功能检测显示，与M1^WT相比，M1^Mif?/?巨噬细胞的总ROS、线粒体超氧化物（O₂^•?）和NO产量均显著降低，提示MIF对于M1巨噬细胞充分发挥其氧化爆发和效应功能至关重要。相反，在M2极化条件下，无论是否存在MIF，精氨酸酶活性均被强烈诱导，且两组间无显著差异，表明M2的核心代谢功能不受MIF缺失的明显影响。

3.2 MIF缺陷降低活化巨噬细胞的线粒体膜电位（MMP）

通过MitoTracker Orange染色和JC-10流式细胞术分析，研究人员发现，在M1、M2和M0+rMIF条件下，Mif^?/?巨噬细胞的MMP均显著低于相应的WT对照组。此外，NAD(P)H脱氢酶活性检测显示，M2^Mif?/?巨噬细胞的代谢活性也显著降低。这些结果表明内源性MIF是维持巨噬细胞活化过程中线粒体膜电位所必需的。

3.3 MIF维持M0巨噬细胞的线粒体效率，而极化影响整体呼吸谱

海马线粒体压力测试结果显示，WT巨噬细胞中，M1和M0+rMIF组的耗氧率（OCR）极低，而M0和M2组则保持较高水平。与WT对应组相比，M0^Mif?/?、M1^Mif?/?和M2^Mif?/?巨噬细胞的基础呼吸、ATP偶联呼吸和最大呼吸能力均显著降低。值得注意的是，M2^Mif?/?巨噬细胞反而表现出更高的备用呼吸容量。这些数据进一步证实MIF缺失损害了线粒体的整体呼吸性能，尤其是在M1活化状态下表现最为明显。

3.4 MIF缺失以极化依赖的方式损害糖酵解和线粒体ATP生成

实时ATP速率测定实验表明，M1巨噬细胞主要依赖糖酵解产生ATP，而M2巨噬细胞则更依赖OXPHOS。与WT相比，M1^Mif?/?巨噬细胞的糖酵解ATP（GlycoATP）和线粒体ATP（MitoATP）均下降；M2^Mif?/?巨噬细胞的MitoATP显著降低（仅为WT的44.27%），而GlycoATP也有一定程度的减少。这表明MIF缺失不仅影响了线粒体功能，也在一定程度上扰乱了糖酵解途径，特别是在M1活化状态下。

讨论与结论总结

本研究通过系统比较WT和Mif^?/?小鼠BMDMs在不同极化条件下的线粒体功能，揭示了MIF作为巨噬细胞线粒体生物能量学调节因子的新角色。讨论部分指出，M1^Mif?/?巨噬细胞虽然能够获得M1表型，但其效应功能（ROS、NO）和线粒体呼吸能力均显著受损，这表MIF的作用更多是支持执行炎症效应所需的代谢能力，而非直接诱导极化方向。相比之下，M2巨噬细胞在MIF缺失后仍能保留精氨酸酶活性和备用呼吸容量，显示出更强的代谢可塑性和补偿能力。

研究结论部分强调：内源性MIF是维持巨噬细胞线粒体生物能量学能力的必要因子，尤其在炎症性M1活化过程中，它支持线粒体膜电位、OXPHOS相关呼吸、ATP生成以及ROS和NO的产生。而在M2巨噬细胞中，核心的替代活化特征在MIF缺失后基本得以保留。这些发现将MIF的生物功能从细胞因子信号传导扩展到代谢许可因子层面，使其能够帮助巨噬细胞满足活化特异性的能量和氧化还原需求。因此，靶向MIF依赖的代谢通路可能为调节炎症、感染、代谢或肿瘤相关疾病中的巨噬细胞功能提供新的策略，但治疗干预需充分考虑巨噬细胞的活化状态、组织环境和干预时机。