FSTL1通过NLRP3-CASP1-GSDMD与BAX-CASP3-GSDME焦亡通路加重LPS诱导的脓毒性肝损伤

《Frontiers in Immunology》：FSTL1 aggravates LPS-induced liver injury through the NLRP3-CASP1-GSDMD and BAX-CASP3-GSDME pyroptosis pathways

　　

肝细胞焦亡（pyroptosis）及其促炎效应对急性肝损伤（acute liver injury）的病理过程具有关键性贡献。FSTL1（卵泡素样蛋白1，follistatin-like protein 1）是一种分泌型糖蛋白（secreted glycoprotein），其参与调控多种细胞死亡通路并促进炎症性疾病进展的作用已被证实。然而，在脓毒症（sepsis）诱导的肝损伤中，FSTL1介导肝细胞焦亡的调控机制仍未阐明。本研究旨在探究FSTL1在脓毒症期间肝细胞焦亡中的作用并评估其治疗潜力。
方法：研究人员通过小鼠腹腔注射脂多糖（LPS，lipopolysaccharide）诱导脓毒性肝损伤。在LPS攻击前，通过腺相关病毒（AAV，adeno-associated virus）介导的基因沉默实现肝细胞特异性FSTL1敲低。在指定时间点采集血清和肝组织。检测血清FSTL1、肝功能标志物（AST，天冬氨酸氨基转移酶；ALT，丙氨酸氨基转移酶），评估组织病理学改变、活性氧（ROS，reactive oxygen species）生成、焦亡通路激活（NLRP3-CASP1-GSDMD及BAX-CASP3-GSDME）、肝脏炎症以及存活率。
结果：血清FSTL1显著升高并与肝损伤严重程度呈正相关。脓毒症期间肝组织FSTL1表达逐渐升高，与疾病进展高度平行。在脓毒性条件下，NLRP3-CASP1-GSDMD与BAX-CASP3-GSDME焦亡通路在肝细胞中均呈时间依赖性激活。值得注意的是，肝细胞特异性FSTL1敲低减弱了ROS生成、抑制了两条焦亡通路、减少了肝脏炎症与组织损伤，并改善了脓毒症小鼠的存活率。
讨论：FSTL1通过双重激活NLRP3-CASP1-GSDMD和BAX-CASP3-GSDME通路，在脓毒症诱导的肝损伤期间促进肝细胞焦亡中发挥关键作用。靶向FSTL1可能是一种颇具前景的脓毒症治疗新策略。

脓毒症（sepsis）是机体对感染的失调反应所导致的可危及生命的器官功能障碍，尽管其在病理机制解析与治疗开发方面取得了进展，发病率和死亡率仍然居高不下。肝脏因在代谢调节与免疫防御中的关键作用而深度参与脓毒症进程，脓毒症患者肝功能障碍或衰竭的死亡率高达54%~68%，因此开发改善脓毒性肝损伤的新策略具有重要意义。焦亡（pyroptosis）是一种炎症性程序性细胞死亡，Gasdermin蛋白家族成员（gasdermin D，GSDMD；GSDME）是关键执行者：炎症小体（如NLRP3，NACHT、LRR和PYD结构域包含蛋白3）激活半胱氨酸天冬蛋白酶-1（CASP1，caspase-1）后，CASP1剪切GSDMD产生GSDMD-N，使质膜通透化并触发焦亡；而GSDME可被半胱氨酸天冬蛋白酶-3（CASP3，caspase-3）特异性剪切。既往研究表明，脓毒症小鼠肝脏中焦亡显著上调，药理学或遗传学抑制肝细胞焦亡可减轻肝损伤并改善存活率。卵泡素样蛋白1（FSTL1，follistatin-like protein 1）是一种在肝脏高表达的分泌型糖蛋白，已被证实参与凋亡、焦亡和铁死亡（ferroptosis）等多种程序性细胞死亡（PCD，programmed cell death）通路并在多种疾病中发挥促炎作用，但其在脓毒症中的潜在作用及调控机制很少被研究，这正是本研究开展的出发点。
为阐明FSTL1在脓毒性肝损伤中的作用，研究人员利用LPS诱导的小鼠脓毒症模型，结合AAV8介导的肝细胞特异性FSTL1基因沉默，系统检测了血清及肝组织FSTL1水平、焦亡通路激活、ROS生成、肝损伤程度与存活率，得出以下结论：FSTL1通过ROS依赖性激活NLRP3-CASP1-GSDMD和BAX-CASP3-GSDME两条焦亡通路促进LPS诱导的肝损伤，FSTL1有望成为脓毒性肝损伤的潜在生物标志物候选（biomarker candidate）和治疗靶点。
本研究主要技术方法包括：采用购自中国医学科学院动物研究所的野生型C57BL/6J小鼠（实验方案经中国人民解放军总医院科研审查委员会批准，批准号No. 2024-X20-40），通过腹腔注射LPS（10 mg/kg）构建内毒素血症模型并设立生存分析队列；经尾静脉注射AAV8-TBG-ShFSTL1或AAV8-TBG-ShCtrl（2×10¹¹载体基因组/只）实现肝细胞特异性FSTL1敲低；运用蛋白质免疫印迹（Western blot）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、苏木精-伊红（HE）染色半定量评分（Suzuki标准）、流式细胞术（流式细胞仪检测细胞死亡及ROS）、激光共聚焦免疫荧光、原代肝细胞分离及N-乙酰半胱氨酸（NAC，N-acetylcysteine）干预，并辅以Spearman秩相关分析、单因素方差分析（one-way ANOVA）和Kaplan-Meier/log-rank生存分析。
研究结果如下：
血清FSTL1与脓毒性肝损伤呈正相关：研究人员在LPS处理后0、6、12、24小时检测血清FSTL1、AST和ALT，发现三者均随脓毒症发展逐渐升高，Spearman相关分析显示循环FSTL1水平与AST、ALT浓度呈正相关，表明FSTL1与脓毒性肝损伤存在密切联系。
LPS处理上调肝细胞FSTL1表达并加重肝损伤：Western blot显示肝细胞FSTL1蛋白在LPS处理后6、12、24小时显著升高；肝匀浆中IL-6和TNF-α逐渐升高且与FSTL1表达正相关；HE染色显示肝组织病理损伤随病程逐渐加重，FSTL1表达与肝损伤程度相关，提示FSTL1是加重LPS诱导肝损伤的重要因素。
LPS诱导肝细胞NLRP3-CASP1-GSDMD和BAX-CASP3-GSDME焦亡通路激活：Western blot显示NLRP3、CASP1、GSDMD、BAX、CASP3、GSDME的蛋白水平在LPS刺激后6、12、24小时逐渐上调；流式细胞术显示肝细胞死亡逐渐增加；肝匀浆中IL-1β、IL-18、乳酸脱氢酶（LDH）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）升高，证实两条焦亡通路在脓毒症中被激活。
建立肝脏特异性FSTL1敲低小鼠：研究人员通过尾静脉注射肝特异性AAV8载体构建条件性敲低小鼠，Western blot证实ShFSTL1小鼠肝脏FSTL1表达显著降低，而肾、心、肺、脾、肠等其他组织无显著变化。
FSTL1缺乏减弱LPS诱导的焦亡通路激活：与ShCtrl+LPS组相比，ShFSTL1+LPS组肝脏NLRP3、CASP1、GSDMD、BAX、CASP3、GSDME表达显著受抑，肝细胞死亡减少，焦亡相关细胞因子及损伤相关分子模式（DAMPs，damage-associated molecular patterns）包括IL-1β、IL-18、LDH、HMGB1的释放被抑制，提示FSTL1缺失显著抑制LPS诱导的炎症性焦亡通路激活。
FSTL1缺乏减轻LPS诱导的肝损伤并提高脓毒症小鼠存活率：条件性敲低FSTL1明显改善肝组织病理损伤、降低血清ALT/AST水平、减少肝匀浆IL-6和TNF-α产生，并显著降低LPS诱导的死亡率。
FSTL1缺乏减少肝细胞ROS生成：体外分离原代肝细胞并用LPS（100 ng/mL）联合ROS清除剂NAC（10 mM）处理24小时，NAC显著降低ROS水平并抑制两条焦亡通路激活、减轻肝细胞焦亡；动物实验中ShFSTL1+LPS组流式细胞术检测的ROS水平及免疫荧光强度均低于ShCtrl+LPS组，提示FSTL1介导的焦亡通路调控与ROS信号相关。
讨论部分指出，既往研究证实血浆FSTL1在脓毒症患者中显著升高且非幸存者浓度更高，本研究进一步发现FSTL1在血清和肝组织的升高与脓毒症严重程度相关，且肝细胞特异性敲低对LPS诱导的肝损伤具有保护作用并增强存活。既往研究表明单独抑制GSDMD不足以挽救脓毒性致死性炎症，GSDMD与GSDME双缺失可显著改善焦亡诱导的炎症损伤并改善存活；当NLRP3-CASP1-GSDMD通路被阻断时，三磷酸腺苷（ATP，adenosine triphosphate）等焦亡激活物可经CASP3/GSDME通路诱导焦亡，这提示联合观察CASP3-GSDME与CASP1-GSDMD通路可加深对人类疾病病理生理过程的理解，而本研究观察到的两条通路时间依赖性激活与FSTL1表达相似。此外，研究证实ROS可经GSDMD和GSDME通路诱导焦亡，而FSTL1敲低可减少ROS积累，支持ROS是FSTL1相关焦亡的关联介质。作者同时承认研究局限：FSTL1调控ROS生成的确切机制尚不清楚，有待进一步研究；仅探讨了FSTL1对脓毒性肝损伤的影响，其对其他器官系统的潜在作用有待阐明；研究仅基于LPS诱导的内毒素血症模型，不能完全模拟临床多微生物性脓毒症，未来需采用盲肠结扎穿孔（CLP，cecal ligation and puncture）模型及临床研究验证；药理学抑制不能完全确立靶点特异性，未来需采用肝细胞特异性FSTL1过表达、拯救实验或GSDMD/GSDME基因敲除等研究确认通路特异性；目前结论基于功能缺失证据，属关联性而非确定性结论。
结论部分（翻译）：总之，本研究揭示FSTL1在肝细胞中发挥促焦亡作用并促进LPS诱发的肝损伤，该作用与ROS依赖性激活NLRP3-CASP1-GSDMD和BAX-CASP3-GSDME两条焦亡通路相关。研究结果表明，FSTL1可作为脓毒性肝损伤监测的潜在生物标志物候选，并凸显其在脓毒症治疗中的潜力。